Скоро практически в каждой больнице можно будет всего за несколько минут определить виды бактерий, ответственных за инфекцию, развивающуюся у пациента. Исследователи из Института физической химии Польской академии наук в Варшаве разработали новую, легко адаптируемую и недорогую аналитическую процедуру. Основную роль играют инновационные биоконъюгаты - люминесцентные, магнитные микрочастицы, покрытые соответствующим образом подобранными бактериофагами.
Когда пациента госпитализируют с запущенной бактериальной инфекцией, такой как сепсис, время становится решающим. Чем раньше удастся определить вид злоумышленника, разоряющего тело, тем больше шансов на успешное лечение. Между тем широко используемые аналитические методы по-прежнему требуют размножения бактерий (что часто занимает несколько дней) или специализированного оборудования, имеющегося лишь в нескольких лабораториях. Однако идентификацию бактерий можно провести практически в любой аналитической лаборатории больницы, а время ожидания результата сокращается до минут, по словам исследователей из Института физической химии Польской академии наук (IPC PAS) в Варшаве. на страницах научного журнала Bioconjugate Chemistry.
Прежде чем начать работу над новой аналитической методикой, исследователи из IPC PAS исходили из того, что она должна позволять значительно быстрее идентифицировать бактерии, чем существующие методы, и ее будет легко внедрить в большом количестве больничных лабораторий, но без каких-либо жертвовать точностью измерения. Дополнительным требованием было то, что анализ должен быть недорогим.
«Быстрее, лучше, дешевле - нам удалось достичь всех этих целей. В этом может убедиться любая заинтересованная сторона, поскольку мы полностью осознавали, что отказались от патентной защиты», - говорит д-р Ян Пачесны (IPC PAS), который руководил исследовательским проектом, финансируемым за счет гранта Польского национального научного центра.
Детектирующим устройством в новой методике идентификации бактерий является проточный цитометр. Несмотря на кажущееся внушительным название, это довольно простое и относительно недорогое оборудование, доступное во многих больницах, где оно обычно используется для анализа крови. В цитометре образец пропускается через сопло, из которого вытекающий поток настолько узок, что все более крупные частицы в растворе, особенно клетки, должны вытекать одна за другой. Поток освещается лазерами и окружен детекторами, которые фиксируют свет, отраженный от отдельных частиц, рассеянный в стороны и излучаемый ими.
Главной проблемой было разработать метод маркировки бактерий, чтобы их можно было легко перехватывать в исследуемом образце и с большой уверенностью идентифицировать с помощью цитометра. Для этого исследователи решили сконструировать специальные биоконъюгаты, то есть комплексы, образованные соединением микрочастиц с биомолекулами. Биологическим элементом служил бактериофаг, представляющий собой вирус, поражающий определенный вид бактерий (экспериментаторы IPC PAS использовали бактериофаг Т4, поражающий бактерии Escherichia coli). Бактериофаги были сопряжены с микрочастицами, способными излучать свет, который легко регистрировался на цитометре, и обладающими магнитными свойствами. Последнее было необходимо, так как позволяло отделить биоконъюгаты от других частиц в образце с помощью простого магнита..
Мы начали с поиска недорогих коммерчески доступных микрочастиц, отвечающих нашим требованиям. Оказалось, что на рынке уже есть подходящие частицы - и именно те, которые мы искали! Их поверхность была покрыта именно такими химические функциональные группы, необходимые для размещения на них практически любого типа бактериофага», - объясняет аспирант Марта Янчук-Рихтер из группы проф. Джоанна Нидзиолка-Йонссон.
Исследователи объединили купленные микросферы с бактериофагами, используя соединение из группы карбодиимидов, известное как EDC (это вещество используется многими химиками для связывания между собой различных частиц). Изображения, полученные с помощью конфокальной микроскопии, подтвердили, что в новых биоконъюгатах обычно к каждой микрочастице прикрепляются два или три бактериофага. Поэтому были получены первые в мире биоконъюгаты с тройными функциями: связывание только с одним видом бактерий, реагирующие на магнитное поле и способные светиться (флуоресцировать).
Процедура идентификации бактерий с помощью таких сконструированных биоконъюгатов проста. Образец - это может быть физиологическая жидкость, полученная от пациента, или пищевой продукт, например морковный сок - разбавляют и затем в раствор добавляют небольшое количество ранее приготовленных биоконъюгатов. После этого требуется некоторое время, чтобы биоконъюгаты прикрепились к бактериям. Далее к пробирке с жидкостью прикладывают магнит и притягивают все биоконъюгаты, в том числе и с прикрепленными бактериями. После выливания остатка пробы и повторного разбавления выпавшего осадка раствор пропускают через цитометр.
Измерение на цитометре обычно занимает около минуты. Результатом является график, на котором мы видим, как все биоконъюгаты рассеивают падающий свет и испускают флуоресценцию. Поскольку мы знаем сигнал, который мы должны получить от чистых биоконъюгатов, без бактерий, мы можем легко определить, содержит ли образец искомые бактерии, и если да, то в какой концентрации», - говорит аспирант Чукаш Рихтер из группы профессора Роберта Холиста.
Испытания в IPC PAS показали, что обычно к каждой бактерии прикрепляется несколько биоконъюгатов. Теоретически таким образом можно было бы обнаружить даже одну бактерию. На практике, однако, возникают определенные ограничения, связанные со свойствами микрочастиц и характеристиками измерительной аппаратуры. Чистые биоконъюгаты могут фактически слипаться в более крупные кластеры, которые генерируют в цитометре такой же сигнал, как и отдельные биоконъюгаты с прикрепленными бактериями.
Биоконъюгаты с одним типом бактериофагов выявляют только один вид бактерий. Однако благодаря простоте приготовления биоконъюгатов заинтересованные госпитальные лаборатории могли самостоятельно и без особых проблем приготовить десяток или даже несколько десятков типов потенциально полезных биоконъюгатов, каждый из которых содержал бактериофаги, поражающие разные виды бактерий. В случае сепсиса, который в большинстве случаев вызывается более чем дюжиной видов бактерий, для идентификации потребовалось бы одновременное выполнение не более дюжины тестов. Вся процедура не должна занимать у квалифицированного лаборанта более часа.