Новое исследование, опубликованное в журнале Metabolic Engineering Journal, описывает метод, основанный на CRISPR/Cas9, который обеспечивает гибкую разработку основных и заменимых ферментов без дополнительной разработки. Это может иметь большое значение для различных аспектов, включая развитие биотехнологического производства фармацевтических препаратов, пищевых добавок, топлива и косметики.
Если у вас есть производственный штамм, это облегчит создание определенных ограничивающих ферментов в пути биосинтеза и повысит эффективность, специфичность или разнообразие. Люди смогут найти лучшие альтернативные варианты ферментов на этом пути и увеличить производство ценных соединений», - говорит Тадас Якочюнас, научный сотрудник Центра биоустойчивости Novo Nordisk Foundation, DTU.
Недавно разработанный метод получил название CasPER и основан на существующих технологиях, таких как CRISPR/Cas9, которые в последние годы использовались для инженерии генома и перепрограммирования дрожжей. Однако новый инструмент позволяет ученым создавать ферменты или их активные домены путем интеграции гораздо более длинных разнообразных фрагментов, что дает возможность нацеливаться на каждый отдельный нуклеотид в определенной области. У дрожжей CasPER смог интегрировать мутагенизированные фрагменты ДНК почти со 100% эффективностью даже мультиплексным способом.
Открытие вариантов ферментов
Углубленная характеристика нового метода позволяет сделать вывод о том, что основное различие между уже существующими методами CRISPR/Cas9 заключается в том, что CasPER позволяет очень эффективно интегрировать и мультиплексировать большие фрагменты ДНК, несущие различные мутации, для создания пулов клеток с сотнями тысячи вариантов ферментов.
В то время как другие методы CRISPR в основном полагаются на интеграцию более коротких последовательностей для диверсификации ДНК и требуют нескольких раундов инженерии, CasPER значительно увеличивает длину сконструированных фрагментов ДНК. Кроме того, не требуется никаких дополнительных шагов, что позволяет быстрее и эффективнее разнообразить ферменты для получения более высоких выходов желаемых химических веществ.
Просмотровая платформа
До введения CRISPR/Cas9 процесс создания основных ферментов, например, в дрожжи. Сегодня существует гораздо больше гибкости в отношении того, на что вы можете ориентироваться, и это делает более жизнеспособным создание ферментов, которые будут более эффективными и специфичными, позволяя им преобразовывать больше субстрата в продукт.
Создание фабрик по производству клеток для производства ценных соединений по-прежнему требует больших затрат и времени, поэтому вложение всех этих денег и времени в разработку должно окупиться. Вам нужно произвести определенное количество продукта, чтобы сделать это коммерчески актуально, и такой инструмент, как CasPER, определенно поможет ускорить и масштабировать этот процесс», - говорит Тадас Якочюнас.
В качестве доказательства концепции в этом исследовании ученые нацелились на несколько основных ферментов в пути мевалоната. Этот путь биосинтеза отвечает за производство стеролов и необходим для большинства живых организмов. Исследованиями на людях он наиболее известен как мишень статинов, класса препаратов, снижающих уровень холестерина. Действие этих препаратов основано на ингибировании некоторых стадий пути. У некоторых бактерий и эукариот этот путь отвечает за производство самого большого класса соединений, называемых изопреноидами.
Чтобы доказать применимость и эффективность CasPER, ученые нацелились на два основных фермента мевалонатного пути и смогли выбрать клеточные фабрики с 11-кратно увеличенным производством каротиноидов.
Большой потенциал в промышленности и научных кругах
В будущем CasPER может широко использоваться как в научных кругах, так и в промышленности для различных целей. Хотя основное применение метода заключалось в ускорении и снижении затрат на разработку и оптимизацию клеточных фабрик, метод также можно применять для любого эксперимента, где требуется диверсификация ДНК.
"Вы можете изучать функции белков для разработки инструментов прогнозирования структуры белков, а также изучать взаимодействия белков с ДНК, субстратами и другими молекулами для диверсификации регуляторных элементов, таких как промоторы, терминаторы и энхансеры", - говорит Тадас Якочюнас.
Метод был апробирован на дрожжах, но его также можно применять и на других организмах с эффективным механизмом гомологичной рекомбинации.