Одним из самых обсуждаемых биологических прорывов за последнее десятилетие стало открытие инструмента редактирования генома CRISPR/Cas9, который может изменять ДНК и потенциально устранять первопричины многих наследственных заболеваний.
Первоначально обнаруженный как часть иммунной системы бактерий Streptococcus pyogenes, ассоциированный с CRISPR белок 9 (CAS9) в своем нативном состоянии распознает чужеродные последовательности ДНК и отключает их.
У бактерий эта система используется для нацеливания на чужеродную вирусную ДНК бактериофагов - ДНК, которую они уже признали врагом на протяжении своей эволюционной истории и включили запись о ней в свою собственную ДНК.
CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные кластерами, произносится как «четкие») представляют собой сегменты ДНК, которые содержат короткие повторы базовых последовательностей, за которыми следуют короткие сегменты «спейсерной ДНК», полученные в результате предыдущего воздействия чужеродной ДНК. Комплекс состоит из белков, которые распутывают ДНК, других белков, которые разрезают двойную спираль в определенном месте, и направляющей РНК, которая может распознавать вражескую ДНК в клетке.
Исследователи, изучающие эту древнюю иммунную систему, поняли, что, изменяя последовательность направляющей РНК для соответствия заданной цели, ее можно использовать для разрезания не только вирусной ДНК, но и любой последовательности ДНК в точно выбранном месте. Кроме того, новые участки ДНК могут быть введены для соединения с вновь разрезанными участками.
Метод был впервые задуман и разработан Дженнифер Дудна (Калифорнийский университет, Беркли) и Эммануэль Шарпантье (Университет Умео) и использовался в культивируемых клетках, включая клетки STEM, и в оплодотворенных яйцах для создания трансгенных животных с целенаправленные мутации, которые помогают изучать генетические функции. CRISPR/Cas9 может воздействовать на многие гены одновременно, что позволяет лечить заболевания, связанные с взаимодействием многих генов.
Метод быстро совершенствуется, и ожидается, что однажды он найдет применение в фундаментальных исследованиях, разработке лекарств, сельском хозяйстве и лечении пациентов с генетическими заболеваниями.
Однако создание целевых мутаций CRISPR/Cas9 в настоящее время дорого и требует много времени, особенно для крупномасштабных исследований. Этот процесс также подвержен ошибкам, что ограничивает его широкое использование. Эти проблемы отчасти связаны с отсутствием полного понимания того, как CRISPR/Cas9 работает на молекулярном уровне.
В ноябре исследовательская группа из Университета Северного Техаса (UNT) под руководством Цзинь Лю использовала суперкомпьютер Maverick в Техасском передовом вычислительном центре (TACC) для выполнения первых полностью атомных молекулярно-динамических симуляций Cas9- катализируемое расщепление ДНК в действии.
Моделирование, опубликованное в Nature Scientific Reports, проливает свет на процесс редактирования генома Cas9. Они также помогли разрешить разногласия по поводу конкретных аспектов разрезания: например, где именно происходят изменения и создает ли Cas9 разрывы с тупыми или ступенчатыми концами с выступами в ДНК.
«В настоящее время существует довольно много проблем с тем, как мы используем это в терапевтических целях. Специфичность и эффективность фермента невысоки», - сказал Лю. «Также трудно доставить фермент в положение редактирования гена. Чтобы решить эти проблемы, во-первых, нам нужно знать, как работает этот фермент. Наши исследования закладывают основу для понимания механизма Cas9».
Ученые ранее определили структуру Cas9 в его неактивном состоянии с помощью рентгеновской кристаллографии, но процесс редактирования генов происходит так быстро, что никакая экспериментальная техника не может зафиксировать изменения его состояния и точно определить, как он работает.
Использование моделирования молекулярной динамики - метода изучения динамики молекул путем моделирования взаимодействия большого количества атомов в течение фиксированного времени - Лю и соавтор Чжичэн Цзо, также из UNT, смогли наблюдать изменения фермента Cas9 в фемтосекундном разрешении и фиксируют переход системы в активное состояние.
Моделирование включало ионы Mg2+, которые, как считается, вызывают изменения конформации Cas9, чтобы он мог функционировать. Исследователи предположили, что ионы Mg2+ вызывают конформационные изменения в активное состояние, облегчая близость активных участков Cas9 и ДНК..
Моделирование, проведенное Лю и Цзо на Maverick, включало 280 000 взаимодействующих атомов. Самой сложной частью, по словам Лю, была эффективная выборка конформационных пространств для определения активного состояния.
«Мы сделали все возможное, чтобы повысить надежность результатов моделирования, - сказал Лю. «Мы сделали несколько длинных траекторий по 200 и 300 наносекунд, а также несколько коротких траекторий по 60 наносекунд, чтобы убедиться, что у нас есть согласованные результаты. Для каждой конфигурации мы выполнили как минимум шесть параллельных симуляций».
В дополнение к изучению того, как комплекс CRISPR/Cas9 переходит в активное состояние, моделирование пролило свет на то, где он перерезал ДНК.
«Обычно люди считают, что он обрезан в одном месте, но нет четких доказательств, подтверждающих это», - сказал Лю, доцент кафедры фармацевтических наук UNT. «Используя наши вычислительные методы, мы определили, что разрезание происходит в другом месте, что может означать, что этот фермент может разрезать ДНК более контролируемым образом. Таким образом, проделав эту работу, мы открываем дверь для разработки более эффективного фермента, который мог бы разрезать ДНК. ДНК более специфическим образом».
Их окончательный вклад ответил на то, привело ли редактирование генома тупые концы или смещенные концы - нерешенный вопрос с практическими последствиями.
CRISPR/Cas9 разрезает обе половины двухцепочечной ДНК. Если он разрежется в одном и том же месте на обеих нитях, это приведет к тупым концам; если бы он обрезал немного в другом месте, это привело бы к смещению концов. Их моделирование показало, что CRISPR/CAS9 создает шахматные концы.
«Это будет очень важно для редактирования генов, потому что ДНК со смещенными концами более управляема, чем ДНК с тупыми концами», - сказала она.
Иок-Хоу Панг, заведующий кафедрой фармацевтических наук UNT, использует CRISPR/Cas9 для проведения экспериментальных исследований глаз в своей лаборатории. Как для своих текущих, так и для будущих исследований он видит ценность более четкого понимания поведения фермента.
«Моя лаборатория использовала систему редактирования генов CRISPR/Cas9 для нокдауна нового белка в культивируемых астроглиальных клетках зрительного нерва мыши», - сказал Панг. «Работа доктора Лю поможет нам понять молекулярное взаимодействие между ферментной системой и ее субстратом и в конечном итоге поможет повысить ее эффективность, что чрезвычайно полезно для этой замечательной молекулярной техники».
В 2015 году под эгидой Национальной академии наук мировые ученые объявили мораторий на использование CRISPR/Cas9 для редактирования генома человека способами, которые могут быть унаследованы (хотя есть признаки того, что исследователи уже нарушили этот запрет). судебный запрет). По их словам, слишком мало известно о процессе и его долгосрочных последствиях. Но исследования, подобные исследованиям Лю, могут однажды сыграть роль в точной настройке этих инструментов и сделать их пригодными для использования человеком.
«Мы пытаемся понять механизм фермента редактирования генома, который может иметь большой потенциал для будущих фармацевтических и терапевтических применений и приблизить нас к тому положению, когда эту технологию можно будет использовать для лечения болезней человека», Лю сказал: «Без ресурсов TACC это исследование было бы невозможно провести».