Микрофлюидика капель произвела революцию в секвенировании РНК одиночных клеток, предложив недорогой и высокопроизводительный метод для геномики отдельных клеток. Однако этот метод имеет ограниченные возможности получения полной информации о транскрипции РНК.
Исследователи из Корнельского университета под руководством Ивейна Де Вламинка, доцента Школы биомедицинской инженерии Майнига, придумали элегантный и недорогой метод, решающий эту проблему. И это не только продвигает вперед геномику отдельных клеток, но и открывает новые возможности для изучения инфекций и иммунной биологии.
"Одновременное мультиплексное секвенирование ампликонов и профилирование транскриптомов в одиночных клетках" недавно было опубликовано в журнале Nature Methods. Исследователь с докторской степенью Мридусмита Сайкия и докторант Филип Бернхэм, оба из лаборатории Де Вламинка, являются ведущими авторами.
Также внесли свой вклад Чарльз Данко, доцент Института здоровья животных Бейкера в Колледже ветеринарной медицины, и Джон Паркер, адъюнкт-профессор вирусологии в Институте Бейкера.
В 2015 году исследователи из Гарвардского университета и Массачусетского технологического института представили метод Drop-seq для одновременной и эффективной идентификации тысяч клеток с использованием капель размером в нанолитр и присвоением уникального идентификатора каждой клетке. РНК.
«Эти технологии очень популярны, потому что они снизили стоимость этих типов анализов и как бы демократизировали их, сделали их очень дешевыми и простыми для многих лабораторий», - сказал Де Вламинк.
Недостаток, однако, заключается в том, что они могут идентифицировать только определенный тип молекулы матричной РНК (мРНК), что ограничивает потенциальный объем анализов. Мессенджерная РНК несет генетическую информацию, скопированную с ДНК в процессе трансляции.
Де Вламинк и его сотрудники придумали простой и недорогой вариант существующего протокола Drop-seq и назвали свой новый метод DART-seq (нацеливание на РНК с помощью капель путем секвенирования отдельных клеток).
В Drop-seq отдельные клетки инкапсулируются мечеными микрочастицами, которые инициируют обратную транскрипцию клеточной мРНК. Группа De Vlaminck разработала эффективный метод ферментативной модификации гранул перед выполнением обычного анализа Drop-seq, который позволяет извлекать и анализировать большее количество молекул, чем доступно при секвенировании Drop-seq.
Кроме того, эта технология может идентифицировать зараженные вирусом клетки и количественно определять экспрессию вируса и генов хозяина, что позволяет исследовать реакцию хозяина на инфекцию на уровне отдельных клеток.
«Один вид вируса может быть очень разнообразным, и это разнообразие позволяет им делать экстраординарные вещи», - сказал Бернхэм. «Поэтому, если вы можете уменьшить масштаб до уровня одной клетки, вы действительно сможете увидеть, как незначительные изменения в вирусе вызывают потенциально огромные изменения в том, как клетка реагирует на эту небольшую мутацию».
Сайкия, у которой двойное назначение в ветеринарном колледже, считает, что DART-seq также поможет информировать о новых подходах к терапии рака.
"Раковые клетки представляют собой очень неоднородную популяцию, - сказала она, - и если вы не смотрите на них на уровне отдельных клеток, вы часто упускаете важную информацию. Так что наши технологии позволяют и это".