Ионные каналы в мембранных везикулах, которые обеспечивают внутриклеточный транспорт белков, играют решающую роль в физиологии клеток. Метод, разработанный командой Ludwig-Maximilians-Universitaet (LMU) в Мюнхене, теперь позволяет изучать их с большей специфичностью, чем когда-либо прежде.
Крошечные мембранные везикулы, известные как эндосомы и лизосомы, служат транспортными средствами для транспорта белковых грузов внутри клеток животных. В мембраны везикул встроены белки, называемые ионными каналами, которые контролируют прохождение электрически заряженных атомных частиц («ионов») в эти внутриклеточные органеллы и из них. Дефекты этих белков играют центральную роль в патогенезе многих заболеваний, и анализ их молекулярных функций имеет жизненно важное значение для разработки эффективных методов лечения этих заболеваний. Дипломированный врач Кристиан Гримм и профессор Кристиан Валь-Шотт с кафедры фармации (директор: профессор Мартин Биль) в LMU Мюнхена являются одними из ведущих европейских специалистов в области использования так называемого метода пэтч-клэмп для изучения ионных каналов в клеточных мембранах.. В последнем выпуске журнала Nature Protocols они описывают, как адаптировали метод для использования с эндолизосомными везикулами. Во втором исследовании, опубликованном в журнале Cell Chemical Biology, они продолжают демонстрировать, как зажатие патчей может быть применено к определенным функциональным классам транспортных пузырьков. Этот прорыв открывает совершенно новые перспективы для характеристики ионных каналов и механизмов, которые их регулируют.
Эндлизосомная система состоит из трех различных классов эндосом - ранних, поздних и рециклирующих эндосом, а также лизосом. Эти различные типы везикул имеют разные функции. Ранние эндосомальные везикулы образуются путем сворачивания участков клеточной мембраны в ответ на активацию, например, рецепторные белки внеклеточными сигнальными молекулами. Это позволяет рецепторам быть удаленными с поверхности и отсоединенными от их активирующих лигандов. Затем рецепторы либо передаются рециклирующим эндосомам и возвращаются на клеточную мембрану, либо доставляются к поздним эндосомам, которые переносят их в лизосомы, где они подвергаются ферментативной деградации. Эта система транспортировки участвует во многих метаболических процессах и играет жизненно важную роль в регуляции метаболизма тяжелых металлов и в правильной локализации специфических мембранных рецепторов. Ионные каналы, обнаруженные в везикулярных мембранах, принимают непосредственное участие во всех этих операциях. «Согласно исследованиям их белковых популяций, лизосомы и эндосомы содержат до 70 различных транспортных белков ионных каналов», - говорит Гримм.
Метод patch-clamp позволяет измерять прохождение заряженных частиц через одиночные ионные каналы в мембранных участках и, следовательно, определять, является ли канал активным или неактивным. Для этого в микропипетку втягивается крошечный участок мембраны, применяя слабое всасывание, таким образом гарантируя, что между мембраной и стенкой пипетки образуется плотное уплотнение. Затем с помощью микроэлектрода можно приложить тестовое напряжение и пропустить ток через любые ионные каналы, присутствующие в пластыре. «Проблема в том, что в нормальном состоянии везикулы слишком малы, чтобы к ним можно было получить доступ с помощью накладной пипетки, поэтому их необходимо увеличить, прежде чем можно будет проводить какие-либо измерения», - говорит Гримм. Однако фармакологические средства, которые до сих пор использовались для этой цели, действуют без разбора на все типы эндолизосомных везикул. Пытаясь обнаружить более специфические агенты, исследователи LMU просмотрели библиотеку соединений и определили особую комбинацию двух биологических токсинов, которая избирательно вызывает увеличение ранних эндосом, заставляя их сливаться друг с другом. Кроме того, им удалось продемонстрировать, что третья молекула избирательно увеличивает поздние эндосомы и лизосомы. Примечательно, что ни одно из этих веществ не влияет на рециркуляцию эндосом.
«Это значительный прогресс, потому что теперь у нас есть два набора инструментов, которые позволяют нам применять более конкретные подходы и выяснять, какие каналы активны в каких типах пузырьков», - объясняет Гримм. Действительно, он и его коллеги использовали новые агенты, чтобы показать, что так называемый ионный канал TRPML3, который контролирует прохождение положительно заряженных катионов и pH (уровень кислотности) внутри везикул, активен как в ранних, так и в поздних эндосомах и лизосомы. Напротив, родственный канал TRPML1 обнаруживается в поздних эндосомах и лизосомах, но не в ранних эндосомах. Мутации в каналах TRPML вносят вклад в патогенез тяжелых врожденных состояний, таких как муколипидозы, редкий класс метаболических заболеваний, которые нарушают функцию нервной системы. «Благодаря нашему распространению фиксации патчей на внутриклеточные везикулы, теперь мы можем работать с этими ионными каналами с большей избирательностью. Это важно и при поиске веществ, способных специфически ингибировать функции тех или иных ионных каналов в терапевтических целях», - отмечает Гримм.