Достижения в оптимизации метода редактирования генов CRISPR/Cas9 в моделях болезней рыбок данио предлагают новый уровень точности и специфичности, ранее недоступный для исследований генетических заболеваний человека.
Широкое разнообразие заболеваний, поражающих людей всех возрастов по всему миру, включая деменцию, нарушения развития, некоторые формы рака, мышечные дистрофии и болезни сердца, являются результатом мутаций в наших генах. Поскольку ученые стремятся понять генетическую основу этих заболеваний и работать над разработкой эффективных методов лечения, наличие генетических моделей заболеваний является ключом к их исследованиям. Хотя большая часть исследований сегодня проводится на клеточных линиях, ученым также необходимо понять, как ген вызывает патогенность на уровне всего организма. Модели заболеваний на животных позволяют исследователям проверять функции генов, которые могут зависеть от взаимодействия между различными типами клеток внутри животного или могут влиять на здоровое развитие эмбрионов по мере их роста.
Экспериментальная мощность в маленьком корпусе
В то время как мыши или плодовые мушки обычно приходят на ум, когда речь заходит о животных моделях в лаборатории, данио данио становится все более популярным по ряду важных причин. Из-за их небольшого размера и недорогого содержания их можно содержать в большом количестве. Они имеют относительно короткий жизненный цикл, достигают половой зрелости через 2-3 месяца и производят до 300 яиц в неделю. Эмбрионы развиваются снаружи и прозрачны, что делает их идеальным инструментом для неинвазивного микроскопического исследования по мере их развития. Эмбрионы рыбок данио также являются отличным инструментом для скрининга наркотиков благодаря их наличию в большом количестве и значительной поверхности контакта с водой, в которой они растут.
Для разработки животных моделей болезней ученые должны иметь возможность манипулировать генами животных, чтобы воспроизвести генетический дефект, вызывающий заболевание. В прошлом методы основывались на нокдауне всего гена или сверхэкспрессии модифицированных генов, содержащих мутации, происходящие от пациента, но они не полностью моделировали болезнь человека с точки зрения уровней экспрессии белка или специфичности клеточного типа, а также требовали много времени. развиваться даже у рыбок данио.
Редактирование генов открывает новые двери
CRISPR/Cas9 - это метод редактирования генов, который в настоящее время революционизирует молекулярную биологию, включая разработку моделей заболеваний. Система происходит от бактериального иммунного ответа, когда короткая последовательность ДНК захватчиков, таких как вирусы, сохраняется в бактериальном геноме. Если бактерия снова заражается, сохраненная последовательность вирусной ДНК помогает направить белок Cas9 в соответствующую область вирусного генома, где Cas9 вызывает разрывы ДНК, которые приводят к уничтожению захватчика. Ученые поняли, что система CRISPR/Cas9 может быть спроектирована так, чтобы доставлять Cas9 в клетки вместе с направляющей молекулой, чтобы указать точное место разреза ДНК. Немедленная доступность свежеоплодотворенных эмбрионов рыбок данио делает их идеально подходящими для редактирования генов CRISPR/Cas9, поскольку эмбрионы могут быть микроинъецированы реагентами на стадии 1-клеточной, и по мере роста эмбриона новые клетки, возникающие из этой первой клетки, будут нести целевая мутация.
Совершенствование моделирования «нокаутных» заболеваний
Крайне важно для моделирования заболеваний, в сочетании с одноцепочечной матрицей для восстановления ДНК после разреза, CRISPR/Cas9 позволил исследователям ввести точные точечные мутации, чтобы воспроизвести те, которые вызывают заболевание у некоторых пациентов. Тем не менее, несмотря на то, что полное «нокаутирование» гена с помощью CRISPR/Cas9 в настоящее время относительно просто, введение специфических точечных мутаций в модель «нок-ин» все еще может быть проблематичным, особенно у рыбок данио, требующих скрининга многих животных, чтобы найти особей, укрывающих желаемое изменение нуклеотида. В трех новых статьях, опубликованных в журнале «Модели и механизмы заболеваний», исследуются возможности использования CRISPR/Cas9 для разработки моделей заболеваний человека у рыбок данио, и предлагаются новые способы преодоления проблем, с которыми все еще сталкиваются при создании моделей заболеваний человека, вызванных конкретными точечными мутациями.
Нет практически никаких ограничений на то, что мы можем сконструировать в рыбках данио или других системах для создания моделей генетических нарушений человека. CRISPR/Cas9 действительно впервые сделал возможным тестирование последствий заболеваний человека генетические варианты в моделях животных», - говорит доктор Лиза Мейвс, ведущий автор статьи из Детского научно-исследовательского института Сиэтла и Вашингтонского университета. Исследования секвенирования генома человека часто выявляют варианты в последовательностях генов, даже если их значение не сразу ясно. Исследовательская группа Мейвса сосредоточила свою работу на использовании моделей рыбок данио CRISPR/Cas9, чтобы проверить, способствуют ли варианты генов, выявленные у людей с врожденными пороками сердца, развитию заболевания.«Значительное повышение эффективности внесения специфических нуклеотидных изменений в геномную последовательность рыбок данио было бы важным достижением в этой области», - говорит Хэнк Фарр, член лаборатории Maves и первый автор статьи.
Также работая над улучшением текущих ограничений на создание модели с нок-ин, ведущий исследователь д-р Энди Уилларт и его группа из Университета Гента изучают, как точечные мутации у рыбок данио с помощью CRISPR/Cas9 и шаблонов одноцепочечной репарации могут ввести ошибок в геноме рыбок данио. «Рыбки данио и CRISPR/Cas9 образуют идеальный дуэт для массового и быстрого создания моделей заболеваний», - говорит Уилларт. «Однако редактирование генома с использованием шаблона одноцепочечной репарации часто происходит ошибочно, и обычно используемые методы анализа не всегда обнаруживают такую ошибочную репарацию. Это может привести к модели с нарушением гена вместо нокаута и возможной неправильной интерпретации экспериментального полученные результаты. Поскольку эти модели в конечном итоге могут быть использованы в терапевтических целях, мы хотим подчеркнуть возможность ошибочного восстановления».
В Нидерландах группа под руководством доктора Йеруна Баккерса из Института Хабрехта и доктора Гийса ван Хаафтена из Медицинского центра Университета Утрехта изучает потенциал технологии CRISPR/Cas9 для разработки специфических для пациента аллелей для моделирования болезней человека.. Ученые использовали CRISPR/Cas9 и шаблон короткой репарации для создания моделей четырех сердечно-сосудистых заболеваний у рыбок данио, вызванных точечными мутациями. Доктор Федерико Тессадори, первый автор статьи, подчеркивает, что «способность вводить точечные мутации, точно воспроизводящие ситуацию у пациентов, имеет первостепенное значение для правильного понимания болезни и для успешной разработки терапевтических стратегий».
Несмотря на различия в подходах и направленности, общее сообщение, проходящее через все три статьи, заключается в том, что рыбки данио обладают огромным потенциалом для создания точных моделей заболеваний человека, вызванных точечными мутациями. Тем не менее, все авторы подчеркивают важность скрининга высокоэффективных направляющих РНК и шаблонов одноцепочечной репарации, а также тщательного тестирования на наличие ошибок после завершения процесса. Также важно признать, что оптимальные экспериментальные условия часто различаются между системами моделирования заболеваний, и всегда будут необходимы определенные шаги по оптимизации при использовании CRISPR/Cas9 для разработки нок-ин моделей на рыбках данио или других модельных организмах.
Работа над улучшением лечения пациентов
Глядя в будущее, ученые будут продолжать совершенствовать методы CRISPR/Cas9 для разработки безошибочных моделей болезней рыбок данио. Использование моделей специфических для пациента мутаций у рыбок данио открывает новые возможности для химического скрининга и разработки новых лекарств. В конечном счете, сотрудничество между исследователями и клиницистами, ухаживающими за пациентами, приведет к еще большему пониманию генетических нарушений человека, что поможет семье лучше понять состояние своего ребенка или направит врача к более эффективным методам лечения.