Количество и типы белков, вырабатываемых нашими клетками, говорят нам важную информацию о нашем здоровье и о том, как работает наш организм. Но имеющиеся у нас методы идентификации и количественного определения отдельных белков неадекватны этой задаче. Мало того, что разнообразие белков неизвестно, но часто аминокислоты изменяются после синтеза посредством посттрансляционных модификаций.
В последние годы был достигнут значительный прогресс в чтении ДНК с использованием нанопор - мельчайших мембран, достаточно больших, чтобы пропускать ненамотанную нить ДНК, но с трудом. Тщательно измерив ионное напряжение нанопоры при пересечении ДНК, биологи смогли быстро определить порядок пар оснований в последовательности. Фактически, в этом году нанопоры были использованы для окончательного секвенирования всего генома человека, что ранее было невозможно с помощью других технологий.
В новом исследовании, опубликованном в журнале Science, исследователи из Технологического университета Делфта в Нидерландах и Университета Иллинойса в Урбана-Шампейне (UIUC) в США расширили эти успехи в области нанопор ДНК и предоставили доказательства концепция, согласно которой тот же метод возможен для идентификации отдельных белков, характеризующих белки с разрешением по одной аминокислоте и исчезающе малым (10^-6 или 1 на миллион) погрешностью.
«Этот считыватель пептидов с нанопорами предоставляет информацию о первичной последовательности пептида, которая может найти применение в фингерпринтинге одиночных молекул белков и идентификации вариантов», - пишут авторы.
Рабочие лошадки наших клеток, белки представляют собой длинные пептидные цепочки, состоящие из 20 различных типов аминокислот. Исследователи использовали фермент под названием геликаза Hel308, который может прикрепляться к гибридам ДНК и пептидов и контролируемым образом протягивать их через биологическую нанопору, известную как MspA (порин A микобактерии smegmatis). Они выбрали геликазу ДНК Hel308, потому что она может протягивать пептиды через поры с наблюдаемыми шагами в полнуклеотида, что близко соответствует отдельным аминокислотам.
Каждый шаг через узкие ворота теоретически создает уникальный сигнал тока, поскольку аминокислота частично блокирует электрический ток, переносимый ионами через нанопору.
Ведущий автор Генри Бринкерхофф, который первым начал эту работу в качестве постдока в лаборатории физика Сеса Деккера, сравнивает белок с ожерельем из бусин разного размера. «Представьте, что вы открываете кран и медленно опускаете это ожерелье в канализацию, в данном случае это нанопоры», - сказал он.«Если большая бусина закрывает слив, вода будет течь только струйкой; если у вас есть бусины поменьше в ожерелье прямо у стока, через сток может пройти больше воды».
С помощью своей техники исследователи могут очень точно измерить величину ионного тока, но не точно, потому что пошаговое прохождение через пору неравномерно. Однако, загружая жидкую среду геликазами, исследователи могут получить множество отдельных, перекрывающихся прочтений одной и той же молекулы, или, говоря их языком, они могут «перемотать» белок и снова прочитать его аминокислотную последовательность. Таким образом, количество ошибок сократилось с 13 % практически до нуля.
Их подход позволил исследователям различать варианты пептидов, которые отличались только одной аминокислотой, что они доказали, создав синтетические пептиды с заменой только одной аминокислоты и показав, что система может их различать.
Но чтобы считать отдельные аминокислоты, им сначала нужно было узнать, какой сигнал производит каждая из них при прохождении через поры. Исследователи обнаружили, что некоторые из этих сигналов могут противоречить здравому смыслу.
Например, когда громоздкая аминокислота триптофан проходила через сужение, ионный ток сначала уменьшался, а затем, вопреки здравому смыслу, увеличивался по сравнению с вариантами малого и среднего размера.
Чтобы понять происхождение этих паттернов, команда полагалась на суперкомпьютерное моделирование вычислительного биолога Алексея Аксиментьева (UIUC), выполненное на нескольких из самых быстрых суперкомпьютеров, доступных академическим исследователям в мире: Frontera, в Texas Advanced Computing Центр; Blue Waters в Национальном центре суперкомпьютерных приложений; и Expanse в Суперкомпьютерном центре Сан-Диего.
Команда Аксиментьева использовала метод, называемый моделированием молекулярной динамики, чтобы воссоздать поведение нанопор, белков и окружающей среды с атомарным разрешением. Такое моделирование не может полностью отразить истинную временную шкалу активности нанопор, которая простирается до секунд. Но создав от 40 до 50 начальных состояний в разных положениях, а затем запустив 70 симуляций параллельно, команда смогла получить статистику для разных подтверждений пептидов. Из них они вычислили ток и сравнили его с экспериментами. Эту вычислительную работу возглавил Цзинцянь Лю, аспирант биофизики лаборатории Аксиментьева.
Моделирование включало 30 000 атомов, взаимодействующих между собой в течение от 200 до 500 наносекунд, и соответствовало экспериментальным результатам. Что еще более важно, они показали, почему определенные аминокислоты производят нелогичные сигналы, проходя через нанопоры. В случае триптофанового варианта сигнал можно проследить до связывания боковой цепи пептида с поверхностью нанопор над сужением.
«Для каждой конкретной конформации мы могли видеть, что произошло с боковой цепью, взаимодействует ли она с поверхностью или остается внутри поры», - сказал Аксиментьев, профессор физики UIUC. «Тогда мы могли бы напрямую установить, что связывание боковой цепи усиливает ток».
Создание симуляций заняло недели на Frontera, который в настоящее время является 10th самым быстрым суперкомпьютером в мире и самым мощным в любом университете. Но на это ушли бы годы с типом вычислительного кластера, доступным в большинстве кампусов. Исследование по идентификации одного белка, за успех которого идет глобальная гонка, было опубликовано журналом Science в качестве «первого выпуска» 4 ноября 2021 года. Исследование было поддержано Голландским исследовательским советом, Национальными институтами здравоохранения США и Среди прочих Национальный научный фонд США.
«Существуют огромные возможности для разработки диагностики путем считывания отдельных белков с использованием этого подхода с нанопорами», - сказал Аксиментьев. «Вычисления будут играть большую роль в развитии этих технологий. Удивительно, что с помощью компьютерных моделей мы можем воспроизвести эксперименты и сказать, какие взаимодействия происходят в наномасштабе».
Кроме того, компьютерные модели обеспечивают другой способ проектирования, позволяя исследователям тестировать нанопоры разного размера или с стратегически расположенными остатками, которые могут генерировать усиленные сигналы.
Требуется дополнительная работа, чтобы выполнить риды длиной более 20 аминокислот и идентифицировать аминокислоты с гетерогенным зарядом, но Аксиментьев рискнул предположить, что через три-пять лет можно будет разработать рабочую модель.
«Мы думаем, что наш новый подход позволит нам обнаружить посттрансляционные изменения, - сказал Деккер, - и, таким образом, пролить свет на белки, которые мы носим с собой».