Исследователь из Университета Висконсин-Мэдисон и его сотрудники из Калифорнийского университета в Сан-Франциско перепрофилировали инструмент редактирования генов CRISPR, чтобы изучить, какие гены являются мишенью для конкретных антибиотиков, давая подсказки о том, как улучшить существующие антибиотики или разрабатывать новые.
Устойчивость болезнетворных патогенов к современным антибиотикам является растущей проблемой, которая, по оценкам, угрожает миллионам жизней и стоит более 2 миллиардов долларов в год в США
«Что нам нужно сделать, так это выяснить новые слабые места у этих бактерий», - говорит Джейсон Питерс, профессор фармацевтических наук из Университета Вашингтона в Мэдисоне, который разработал новую систему.
Техника, известная как Mobile-CRISPRi, позволяет ученым проводить скрининг действия антибиотиков в широком спектре патогенных бактерий.
Используя форму бактериального секса, исследователи перенесли Mobile-CRISPRi из обычных лабораторных штаммов в различные бактерии, включая даже малоизученный микроб, обитающий на сырной корке. Эта простота переноса делает этот метод благом для ученых, изучающих любое количество бактерий, вызывающих болезни или укрепляющих здоровье.
Петерс работал с Кэрол Гросс, Ореном Розенбергом и другими коллегами из Калифорнийского университета в Сан-Франциско и других учреждениях над разработкой и тестированием Mobile-CRISPRi. Система снижает выработку белка целевыми генами, позволяя исследователям определить, как антибиотики подавляют рост патогенов. Эти знания могут помочь в проведении исследований по преодолению устойчивости к существующим лекарствам.
Исследователи опубликовали свои выводы 7 января в журнале Nature Microbiology. Они воспользовались все более популярным молекулярным инструментом CRISPR, но уникальным способом.
«Большинство людей, когда они думают о CRISPR, думают о редактировании генов», - говорит Питерс, который получил докторскую степень в Университете Вашингтона в Мэдисоне и недавно поступил на работу в Фармацевтическую школу в качестве доцента. «Но это не то, чем я занимаюсь».
Обычно система CRISPR нацелена на ген, где она разрезает ДНК на две части. Ген можно редактировать, пока клетка восстанавливает повреждения.
Но Питерс и его сотрудники работали с защищенной формой CRISPR, известной как CRISPRi. CRISPRi спроектирован таким образом, что он не может разрезать ДНК. Вместо этого он просто сидит на ДНК, блокируя доступ других белков к определенному гену и его включение. Результатом является более низкая экспрессия гена и уменьшенное количество белка, который он кодирует.
Исследователи показали, что если они уменьшали количество белка, на который нацелен антибиотик, бактерии становились гораздо более чувствительными к более низким уровням препарата, что свидетельствует о связи между геном и препаратом. Таким образом, тысячи генов одновременно могут быть проверены как потенциальные мишени для антибиотиков, что поможет ученым понять, как работают антибиотики и как их улучшить.
Чтобы сделать CRISPRi мобильным, исследователи разработали методы переноса системы с обычных лабораторных моделей, таких как кишечная палочка, на болезнетворные виды, которые часто труднее изучать. Команда Питерса обратилась к одному из естественных способов соединения бактерий и обмена ДНК, своего рода бактериальному сексу, называемому конъюгацией. Бывший профессор генетики Университета Вашингтона в Мэдисоне Джошуа Ледерберг открыл конъюгацию, что принесло ему Нобелевскую премию в 1958 году.
«По сути, вы смешиваете бактерии вместе, и это происходит», - говорит Питерс о конъюгации. «Легче некуда».
Используя конъюгацию, команда Петерса перенесла Mobile-CRISPRi на патогены Pseudomonas, Salmonella, Staphylococcus и Listeria, среди прочих.
«Это означает, что теперь вы можете проводить исследования того, как антибиотики действуют непосредственно на эти патогены», - говорит Питерс. «Это могло бы дать нам лучшее представление о том, как эти препараты действуют на разные организмы, и, возможно, что мы можем сделать, чтобы улучшить их».
Настоящим испытанием мобильности Mobile-CRISPRi стал сыр.
С возрастом сыр создает свой собственный ландшафт микробов. Ученые только начинают исследовать огромное разнообразие бактерий и грибков в сырах, которые придают сыру сложный вкус. Одна из этих бактерий, Vibrio casei, была обнаружена на кожуре французского сыра в 2010 году коллегой Питерса Рэйчел Даттон из Калифорнийского университета в Сан-Диего.
Манипуляции с генами у зарекомендовавших себя лабораторных бактерий, таких как E. coli, просты, но часто нет возможности изучить гены бактерий, недавно выделенных из окружающей среды, таких как V. casei. Но Mobile-CRISPRi легко перенесли в штамм, что открыло новые возможности для понимания того, как бактерии колонизируются и способствуют старению сыра. В качестве доказательства концепции V. casei предполагает, что Mobile-CRISPRi должен быть полезен для любого количества ранее недостаточно изученных бактерий, как тех, которые наносят нам вред, так и тех, на которые мы полагаемся.
Теперь Питерс предлагает Mobile-CRISPRi другим исследователям для изучения выбранных ими микробов.
«Теперь он будет полностью доступен для сообщества», - говорит Питерс. «Теперь это дает людям путь вперед».