Инженеры-биомедики из Университета Дьюка разработали метод повышения точности технологии редактирования генома CRISPR в среднем в 50 раз. Они считают, что его можно легко перевести в любой из постоянно расширяющихся форматов технологии редактирования.
Подход добавляет к направляющей РНК короткий хвост, который используется для идентификации последовательности ДНК для редактирования. Этот добавленный хвост загибается и связывается сам с собой, создавая «замок», который может быть снят только целевой последовательностью ДНК.
Исследование опубликовано в Интернете 15 апреля в журнале Nature Biotechnology.
«CRISPR, как правило, невероятно точен, но есть примеры, показавшие нецелевую активность, поэтому в этой области наблюдается широкий интерес к повышению специфичности», - сказал Чарльз Герсбах, доцент кафедры биомедицинской инженерии семьи Руни. герцог. «Но решения, предложенные до сих пор, не могут быть легко переведены между различными системами CRISPR».
CRISPR/Cas9 - это защитная система, которую бактерии используют для нацеливания и расщепления ДНК вторгшихся вирусов. В то время как первая версия технологии CRISPR, разработанная для работы в клетках человека, возникла из бактерии под названием Streptococcus pyogenes, многие другие виды бактерий используют другие версии.
Ученые в этой области потратили годы на поиск новых систем CRISPR с желаемыми свойствами и постоянно пополняют арсенал CRISPR. Например, некоторые системы меньше по размеру и лучше подходят для размещения внутри вирусного вектора для доставки в клетки человека для генной терапии. Но независимо от их индивидуальных способностей, все время от времени производили нежелательные генетические изменения.
Универсальным свойством систем CRISPR является использование молекул РНК в качестве направляющих, которые ориентируются на целевую последовательность ДНК в геноме. Как только направляющая РНК находит свою комплементарную генетическую последовательность, фермент Cas9 действует как ножницы, которые разрезают ДНК, облегчая изменения последовательности генома. Но поскольку длина каждой самонаводящейся последовательности составляет всего 20 нуклеотидов, а геном человека содержит около трех миллиардов пар оснований, приходится многое перебирать, и CRISPR иногда может ошибаться с последовательностями, на одну или две пары которых не хватает совершенства.
Один из способов повысить точность CRISPR - потребовать, чтобы две молекулы Cas9 связывались с противоположными сторонами одной и той же последовательности ДНК, чтобы сделать полный разрез. Хотя этот подход работает, он добавляет в систему больше частей, увеличивая ее сложность и усложняя доставку.
Другой подход заключался в генной инженерии белка Cas9, чтобы сделать его менее энергичным, чтобы было меньше шансов поторопиться и совершить ошибку. Хотя это также дало многообещающие результаты, этот тип белковой инженерии трудоемок, и такие усилия специфичны для каждой системы CRISPR.
«Похоже, что почти каждую неделю обнаруживается новая система CRISPR, которая обладает каким-то уникальным свойством, которое делает ее полезной для конкретного приложения», - сказал Герсбах. «Проводить обширную переработку каждый раз, когда мы находим новый белок CRISPR, чтобы сделать его более точным, - это не простое решение».
«Мы сосредоточены на решении, которое не добавляет дополнительных частей и является общим для любой системы CRISPR», - сказал Дьюран Кочак, аспирант, работающий в лаборатории Герсбаха, который руководил этим проектом. «Что общего у всех систем CRISPR, так это направляющая РНК, и эти короткие РНК гораздо проще сконструировать».
Решение Герсбаха и Кочака состоит в том, чтобы удлинить направляющую РНК на целых 20 нуклеотидов таким образом, чтобы она сворачивалась сама на себя и связывалась с концом исходной направляющей РНК, образуя форму шпильки. Это создает своего рода замок, который очень трудно сместить, если хотя бы одна пара оснований неверна в последовательности ДНК, которая исследуется на предмет потенциального разреза. Но поскольку направляющая РНК предпочитает связываться с ДНК, а не с самой собой, правильная комбинация ДНК все же способна взломать замок.
«Мы можем точно настроить силу блокировки настолько, чтобы направляющая РНК продолжала работать, когда она соответствует правильному совпадению», - сказал Кочак.
В статье Кочак и Герсбах показывают, что этот метод может повысить точность разрезов, сделанных в клетках человека, в среднем в 50 раз в пяти различных системах CRISPR, полученных из четырех разных бактериальных штаммов. А в одном случае это улучшение возросло более чем в 200 раз.
«Это довольно простая идея, несмотря на то, что Дьюран провел несколько лет исследований, чтобы показать, что она работает именно так, как мы думаем», - сказал Герсбах. «Это хорошее, элегантное решение для избавления от нецелевой активности».
Двигаясь вперед, исследователи надеются увидеть, со сколькими различными вариантами CRISPR может работать этот подход, а также завершить углубленную характеристику того, как именно работает механизм блокировки, чтобы увидеть, есть ли различия между вариантами CRISPR. И поскольку эти эксперименты проводились на культивируемых клетках, исследователи хотят увидеть, насколько этот подход может повысить точность CRISPR в реальной животной модели заболевания.