Инженеры-химики Массачусетского технологического института разработали новый генетический переключатель, который позволяет им резко повысить выработку бактериями полезных химических веществ путем отключения конкурирующих метаболических путей в клетках.
В статье, опубликованной в выпуске журнала Nature Biotechnology от 13 февраля, исследователи показали, что они могут значительно увеличить выход глюкариновой кислоты, химического вещества, которое является предшественником таких продуктов, как нейлон и моющие средства. Исследователи говорят, что этот генетический переключатель также может быть легко заменен бактериями, которые производят другие продукты.
Мы можем сконструировать микробные клетки, чтобы они производили множество различных химических веществ из простых сахаров, но клетки предпочли бы использовать эти сахара для роста и размножения. «химическая фабрика», но не настолько, чтобы мы не могли направить достаточное количество сахаров на путь производства больших количеств наших целевых молекул», - говорит Кристала Пратер, адъюнкт-профессор химического машиностроения Массачусетского технологического института и старший автор исследования..
Ведущий автор статьи - Апурв Гупта, аспирант Массачусетского технологического института. Другими авторами являются Ирэн Брокман-Рейзман, бывшая аспирантка Массачусетского технологического института, которая сейчас является доцентом Технологического института Роуз-Халман; и Кристофер Рейш, бывший постдоктор Массачусетского технологического института, который сейчас является доцентом Университета Флориды.
Динамический переключатель
В течение десятилетий ученые манипулировали генами микробов, чтобы заставить их производить большое количество продуктов, таких как инсулин или гормон роста человека. Часто этого можно добиться, просто добавив ген желаемого продукта или усилив экспрессию существующего гена.
В последнее время исследователи пытаются сконструировать микробы для производства более сложных продуктов, включая фармацевтические препараты и биотопливо. Обычно для этого требуется добавить несколько генов, кодирующих ферменты, катализирующие каждый этап общего синтеза.
Во многих случаях этот подход также требует отключения конкурирующих путей, которые уже существуют в клетке. Однако время отключения важно, потому что, если конкурирующий путь необходим для роста клеток, его отключение ограничивает размер популяции, и бактерии не будут производить достаточное количество желаемого соединения.
Лаборатория Пратера ранее разработала E. coli для производства глюкариновой кислоты, добавив три гена - по одному от дрожжей, мышей и штамма бактерий, называемого Pseudomonas syringae. Используя эти три гена, бактерии могут трансформировать соединение, называемое глюкозо-6-фосфатом, в глюкариновую кислоту. Однако глюкозо-6-фосфат также является промежуточным звеном в критическом метаболическом пути, который расщепляет глюкозу и превращает ее в энергию, необходимую клеткам для роста и размножения.
Чтобы генерировать большое количество глюкариновой кислоты, исследователи должны были придумать способ отключить путь расщепления глюкозы, позволяя направить глюкозо-6-фосфат на альтернативный метаболический путь. Однако им нужно было тщательно рассчитать время выключения, чтобы популяция клеток была достаточно большой для производства значительного количества глюкариновой кислоты. Что еще более важно, они хотели сделать это без добавления каких-либо новых химикатов или какого-либо изменения условий процесса.
«Идея состоит в том, чтобы автономно остановить рост клеток в середине производственного цикла, чтобы они действительно могли направить все доступные сахара глюкозы на производство глюкариновой кислоты», - говорит Гупта.
Для достижения этого исследователи воспользовались феноменом, известным как ощущение кворума, которое используется многими видами бактерий для координации регуляции генов в ответ на плотность их популяции.
В дополнение к добавлению генов, отвечающих за выработку глюкариновой кислоты, исследователи сконструировали каждую клетку так, чтобы она производила белок, который синтезирует маленькую молекулу под названием AHL. Клетки выделяют эту молекулу в окружающую среду, и когда концентрация, окружающая клетки, достигает определенной точки, она активирует переключатель, который заставляет все клетки перестать вырабатывать фермент, называемый фосфофруктокиназой (Pfk), который является частью пути расщепления глюкозы.. Когда этот фермент отключен, глюкозо-6-фосфат накапливается и направляется на альтернативный путь, производящий глюкариновую кислоту. Создав библиотеку клеток, вырабатывающих АГЛ с разной скоростью, исследователи смогли определить наилучшее время для отключения Pfk.
Используя этот переключатель, исследователи смогли генерировать около 0,8 грамма глюкариновой кислоты на литр бактериальной смеси, в то время как клетки, которые были сконструированы для производства глюкариновой кислоты, но не имели метаболического переключателя, практически не производили ее.
Альтернативные пути
Этот тип переключения также должен быть применим к другим метаболическим путям, поскольку генетическую цепь можно настроить так, чтобы отключить другие гены.
Чтобы продемонстрировать эту универсальность, исследователи проверили свой подход на метаболическом пути, который производит молекулу под названием шикимат, которая является предшественником нескольких различных аминокислот, а также является ингредиентом некоторых лекарств, включая препарат от гриппа Тамифлю. Они использовали молекулу AHL, чувствительную к кворуму, чтобы отключить фермент, который продвигает шикимат дальше по пути синтеза аминокислот, позволяя шикимату накапливаться в клетках. Без переключателя клетки не могли бы накапливать шикимате.
Команда Массачусетского технологического института сейчас работает над стратегиями создания нескольких уровней автономного управления, позволяющих им отключать один путь и одновременно включать другой.