Исследователи из Венского биоцентра разработали протокол тестирования на SARS-CoV-2, который позволяет обрабатывать десятки тысяч образцов менее чем за 48 часов. Метод под названием SARSeq опубликован в журнале Nature Communications и может быть адаптирован ко многим другим патогенам.
Пандемия COVID-19 длится уже более года и продолжает оказывать огромное влияние на нашу жизнь. Хотя некоторые страны начали ускоренные кампании вакцинации, многие все еще ждут крупномасштабных программ иммунизации и эффективной противовирусной терапии - прежде чем это произойдет, миру необходимо срочно восстановить подобие нормальной жизни.
Один из способов приблизить нас к этой точке - массовое параллельное тестирование. Молекулярные тесты, выявляющие наличие SARS-CoV-2, стали лучшим способом изоляции положительных случаев и сдерживания распространения вируса. Было предложено несколько методов, некоторые из которых обнаруживают вирусные белки в мазках из носоглотки (например, тесты на антигены), а некоторые обнаруживают присутствие вирусной РНК в мазках, образцах полоскания или образцах слюны (например, тесты на обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию). или ОТ-ПЦР).
Хотя тесты на антигены облегчают некоторые логистические аспекты массового тестирования, их способность обнаружения относительно слаба - инфицированные люди, несущие небольшое количество вируса, остаются незамеченными и могут продолжать заражать других людей. ПЦР-тесты, с другой стороны, более чувствительны, потому что они размножают фрагменты вирусного генома перед сканированием образцов на наличие вируса. Однако они полагаются на обнаружение флуоресцентных меток, которые маркируют вирусные последовательности, а это означает, что объединение образцов, полученных от разных людей, делает процесс довольно неэффективным: если пул дает положительный результат, все образцы в пуле должны быть снова протестированы индивидуально, чтобы идентифицировать вирус. источник флуоресцентного сигнала. Требуется слишком много машин, слишком дорогих, слишком медленных.
Во время самого первого карантина ученые Венского биоцентра обдумывали ситуацию: должен быть способ расширить масштабы тестирования. Ульрих Эллинг, руководитель группы в Институте молекулярной биотехнологии Австрийской академии наук (IMBA), и Луиза Кочелла, руководитель группы в Научно-исследовательском институте молекулярной патологии (IMP), решили направить свое разочарование в инновационное решение. Руководитель группы IMP Александр Старк и постдок IMBA Рамеш Йелангандула объединили свои усилия, и проект пошел в гору.
Объединив свой опыт в области геномики, биохимии РНК и анализа данных, они разработали метод, позволяющий проводить тестирование больших групп на наличие SARS-CoV-2 с той же чувствительностью, что и обычные ПЦР-тесты. SARSeq, или «Анализ слюны с помощью секвенирования РНК», обеспечивает высокую чувствительность, специфичность и способность обрабатывать до 36 000 образцов менее чем за 48 часов. Метод теперь опубликован в журнале Nature Communications.
Принцип тестирования концептуально прост: образцы отдельных пациентов собираются в лунки планшета для тестирования - по одной лунке на каждый образец. Затем фрагмент вирусной РНК, уникальный для SARS-CoV-2 - нуклеокапсидный ген - селективно преобразуется в ДНК и подвергается ПЦР-амплификации в любой лунке, содержащей его.
«Амплификация вирусного материала из отдельных образцов до максимальной гомогенизирует его количество в положительных образцах, что делает SARSeq очень чувствительным», - объясняет Луиза Кочелла. «Из тысяч образцов, которые мы могли бы тестировать одновременно, некоторые могут содержать в 10 миллионов раз больше частиц коронавируса, чем другие - если бы мы объединили такие образцы перед амплификации, образцы с большим количеством вирусного материала могли бы маскировать другие положительные случаи».
Что отличает этот первый шаг от обычного ПЦР-теста, так это то, что каждый образец получает уникальный набор коротких последовательностей ДНК, или штрих-кодов, которые прикрепляются к амплифицирующейся вирусной ДНК. На втором этапе амплификации все образцы из одного планшета объединяются в одну лунку, которая получает второй набор уникальных штрих-кодов ДНК. Содержимое нескольких планшетов можно снова объединить, поскольку молекулы ДНК из каждого образца несут уникальную комбинацию двух наборов штрих-кодов. Эта стратегия объединения и штрих-кодирования делает SARSeq очень специфичным и масштабируемым.
Мы сочетаем чувствительность ПЦР с высокой производительностью технологии секвенирования следующего поколения, или NGS, которая используется для секвенирования генома человека. Машина NGS обрабатывает объединенные образцы и сообщает нам, какие образцы содержали какой-либо SARS- Материал CoV-2. Штрих-коды позволяют нам отличить каждый положительный образец от других и проследить его до пациента», - говорит Рамеш Елагандула, первый автор исследования. Более того, метод на основе NGS позволяет параллельно тестировать несколько РНК, включая РНК, контролирующие качество образца, или РНК других патогенов для дифференциальной диагностики.
«Центр секвенирования нового поколения и другие коллеги из Венского биоцентра оказали огромную помощь в разработке и оптимизации метода», - говорит Александр Старк. «С нашими машинами, самодельными ферментами и аналитическим конвейером мы ожидаем, что каждый тест будет стоить менее пяти евро».
Процедура тестирования может выполняться параллельно с существующей диагностикой и не зависеть от узких мест в цепочках поставок. Поэтому он не конкурирует с другими методами тестирования реагентов или оборудования.
Мы разработали SARSeq, чтобы попытаться обойти ограничения других тестов и параллельно обработать тысячи образцов. Это не только отличный метод обнаружения SARS-CoV-2, но его также можно применять для другие респираторные патогены, такие как вирус гриппа, риновирусы простуды и потенциально многие другие», - говорит Ульрих Эллинг.
Принципы, лежащие в основе SARSeq, просты и применимы к любому респираторному патогену. Поскольку население мира стремительно растет вместе с нашей близостью к животным, передовые методы диагностики, такие как SARSeq, будут иметь решающее значение для предотвращения распространения болезней в будущем со скоростью лесного пожара.