Понимание того, как белки и другие молекулы перемещаются внутри клеток, важно для понимания того, как функционируют клетки. Ученые используют эксперимент под названием «Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания» или FRAP, чтобы исследовать это молекулярное движение, и теперь исследователи из Университета Брауна разработали метод математического моделирования, который делает FRAP гораздо более полезным.
Традиционно данные FRAP использовались для измерения молекулярной диффузии - пассивного дрейфа молекул внутри желеобразной цитоплазмы внутри клетки. Но эти молекулярные движения не всегда так пассивны. Во многих клеточных процессах молекулы могут активно транспортироваться молекулярными моторами, которые буксируют молекулы, подобно локомотивам, тянущим за собой товарные вагоны.
«Мы знаем, что активный транспорт важен во многих сотовых системах, но не было никакого способа получить его из данных FRAP», - сказала Вероника Чиоканель, доктор философии. студент Брауновского отделения прикладной математики. «Мы разработали метод моделирования для данных FRAP, который включает активный транспорт и может дать количественную оценку того, как работает эта динамика».
В статье, опубликованной в журнале Biophysical Journal, Чоканель и ее коллеги продемонстрировали технику, описав новые подробности о том, как яйцеклетки перераспределяют генетический материал, прежде чем они начнут делиться, чтобы сформировать эмбрион.
Получение большего от FRAP
Для проведения эксперимента FRAP ученые помечают молекулы, которые они хотят наблюдать, светящимися флуоресцентными белками. Затем они воздействуют на интересующую область лазером, который деактивирует некоторые флуоресцентные белки и создает маленькое темное пятно внутри светящейся массы. Затем ученые наблюдают, как темное пятно рассеивается, что происходит постепенно по мере того, как затемненные молекулы уходят из пятна, а все еще флуоресцентные молекулы вплывают внутрь. Количество флуоресценции в пятне с течением времени называется кривой восстановления.
Кривая восстановления затем может быть введена в математическую модель, которая генерирует коэффициент диффузии, среднюю скорость, с которой молекулы дрейфуют. Некоторые модели также могут определять скорость связывания (скорость, при которой молекулы перестают двигаться, присоединяясь к какой-либо другой молекуле или субстрату), но не было ни одной, которая могла бы иметь дело с активным транспортом..
Ciocanel намеревался создать его в сотрудничестве с лабораторией под руководством Кимберли Моури, профессора биологии в Брауновском университете.
Активный транспорт в яйцеклетках
Одним из объектов, которые изучает лаборатория Моури, является локализация РНК в яйцеклетках или ооцитах. Перед делением с образованием эмбрионов ооциты перераспределяют информационную РНК - критические генетические молекулы - от ядра клетки к внешней мембране на одной из сторон клетки. Этот процесс происходит у разных видов животных и необходим для нормального развития эмбриона. Лаборатория Моури изучает его у вида лягушек, называемого Xenopus laevis, потому что ооциты этого вида относительно велики и их легче наблюдать.
Моури и другие исследователи показали, что активный транспорт с помощью молекулярных моторов, наряду с диффузией, вероятно, важен для процесса локализации в ооцитах Xenopus. Было также предположение, что транспорт не был однонаправленным от ядра к мембране. Моури провел эксперименты, предполагающие, что молекулы мРНК действительно время от времени движутся обратно к ядру во время процесса. Но зафиксировать всю эту динамику с помощью FRAP было невозможно.
Работая с Бьёрном Сандстеде, заведующим кафедрой прикладной математики Брауна, Чоканель разработал модели, использующие наборы дифференциальных уравнений в частных производных, которые могли отражать активную динамику. Одна модель зафиксировала два состояния молекулярного движения: простую диффузию и активный транспорт в одном направлении. Вторая, более сложная модель, учитывает диффузию, двунаправленное движение, а также возможность того, что некоторые молекулы остаются неподвижными в течение определенного периода времени. Затем Ciocanel разработал набор численных методов для решения модели и расчета скоростей активного транспортного движения.
Как только модели были созданы и их можно было решить численно, Ciocanel запустил их на синтетических данных FRAP из гипотетической системы, в которой был известен вклад активного транспорта. Она показала, что модели могут правильно воспроизводить активную динамику из синтетических данных.
Проверив модели, исследователи применили их к реальным данным экспериментов FRAP на Xenopus и смогли пролить новый свет на процесс локализации РНК.
«Мы смогли количественно оценить вклад каждого из механизмов», - сказал Чоканел. «Мы можем предсказать, какая часть мРНК диффундирует, движется вверх и вниз или останавливается по пути».
Модели также смогли подтвердить небольшие, но важные нюансы в динамике. Например, исследование показало, что двунаправленный транспорт более заметен в той части клетки, которая находится ближе всего к мембране.
Новые идеи, подобные этим, могут в конечном итоге помочь ученым получить более полную картину динамики этого критического клеточного процесса. Но это далеко не единственная ситуация, в которой этот метод может быть полезен. Известно, что активный транспорт происходит во многих клеточных процессах. Синаптическая активность в головном мозге, например, связана с активной локализацией мРНК.
«Всякий раз, когда есть активный транспорт, - сказал Сандстеде, - этот метод позволяет вам узнать о том, что происходит».