С помощью новых инструментов для секвенирования и сборки генома ученые-растения могут больше узнать о функциях и эволюции крайне разрушительных патогенов растений, которые не поддаются приручению фунгицидами, антибактериальными и противовирусными препаратами.
Но использование этих геномных технологий - непростая задача. Процесс требует не только времени, но и денег. В недавней статье, опубликованной в журнале Molecular Plant-Microbe Interactions, Дэвид Хаак и Джон Макдауэлл из Школы наук о растениях и окружающей среде Колледжа сельского хозяйства и наук о жизни доказали, что эти дорогостоящие процессы можно улучшить, объединив два поколения технологий.
То, что раньше требовало полутора лет и 2 миллионов долларов, теперь можно сделать за девять дней за 1000 долларов, и технология работает с большей точностью и применимостью в полевых условиях, чем когда-либо прежде.
Подумайте об этом как о библиотеке, полной книг, которые полностью написаны на две трети или три четверти. Дэвид разработал технологию, с помощью которой он мог пойти в библиотеку и очень быстро закончить эти книги. и очень точно по очень низкой цене», - сказал Макдауэлл, профессор биотехнологии J. B. Stroobants.
До того, как этот проект начался, Хаак, доцент, и его команда пытались доказать, что можно создать законченную сборку за относительно короткий период времени, но для проверки им нужен был относительно сложный геном. их теория. Через несколько бесед в коридоре Хаак и его студенты объединили усилия с Макдауэллом и его командой, чтобы распутать сложный геном Phytophthora capsici.
P. capsici - представитель действительно разрушительной группы патогенов. Его эволюционный родственник - патоген, вызвавший Ирландский картофельный голод в 19 веке, унесший жизни не менее миллиона человек и ставший причиной не менее миллиона больше для перемещения. Эти патогены до сих пор вызывают трудности», - сказал Макдауэлл. «Одна из причин этого заключается в том, что их геномы изысканно сконфигурированы, чтобы позволить им развиваться в обход вмешательств, которые фермеры проводят в поле».
Микроскопическое изображение большого корня, который делит фотографию на две диагональные части. На каждой стороне корня есть много спор P. capsici, которые напоминают леденцы.
Изображение спор P. capsici, прикрепленных к корню арабидопсиса и инициирующих процесс проникновения. Джон Херлихи для Технологического института Вирджинии.
У этого вида патогенов гены вирулентности часто располагаются в бедных генами областях, чередующихся с повторяющимися областями генома. Эти повторяющиеся участки склонны к быстрой эволюции и являются ключом к пониманию его патогенности или способности вызывать заболевание.
Чтобы лучше понять внутреннюю работу P. capsici, ученые должны извлечь образец ДНК патогена и провести генетическое секвенирование. Генетическое секвенирование - это процесс, который определяет порядок азотистых оснований - или As, Cs, Gs и Ts - которые составляют ДНК организма.
Однако геномное секвенирование может одновременно считывать только определенное количество сегментов ДНК. Затем ученые должны взять эти небольшие последовательности и собрать их заново, чтобы ДНК была представлена в правильном порядке.
Создание данных о последовательности на самом деле не проблема. Это сборка этих данных. Это соединение информации о последовательности в правильном порядке. Богатые повторами области иногда заставляют нас соединять два гена, которые не принадлежать друг другу или разделить полный ген на две половины, потому что мы думаем, что повтор идет прямо посередине», - сказал Хаак.
В общем и целом, расшифровка генома организма требует мощных технологий и терпения. И хотя биоинформационные технологии за эти годы сделали большой скачок вперед, каждое новое поколение не обязательно лучше предыдущего. У каждого поколения технологий есть свои сильные стороны.
С использованием технологии первого поколения для секвенирования генома P. capsici потребуется полтора года и около 2 миллионов долларов. Но с технологией Хаака от извлечения ДНК до полированной сборки потребуется всего девять дней, а стоимость всего 1000 долларов. время. А технология размером с флешку.
Технология второго поколения выполняет короткие сборки чтения, которые чрезвычайно точны; однако они плохо охватывают повторяющиеся области. И когда ученым приходится возвращаться назад и заново собирать геном, существует реальная вероятность ошибки.
«Что происходит с короткими чтениями, так это то, что мы не знаем, где эти повторы начинаются и заканчиваются, поэтому мы не знаем, где их поместить, чтобы расположить их должным образом», - сказал Хаак.
Oxford Nanopore Technologies (ONT) MinION, или долгочитаемое секвенирование, представляет собой технологию секвенирования третьего поколения, но у нее есть противоположная проблема: она гораздо менее точна, но может дать им лучшую общую картину, охватывая через эти критические повторяющиеся области.
Хаак и его команда объединили эти технологии второго и третьего поколения, чтобы использовать точность первого с возможностью охвата повторяющихся областей последнего. Это лучшее из обоих миров.
Применив эту новую технологию к P. capsici, Хаак и Макдауэлл испытали настоящий шок. Хаак и его группа обнаружили, что геном в 1,5 раза больше, чем считалось ранее.
Это 30 процентов генома, о существовании которых мы даже не подозревали, и эта конкретная часть генома, несомненно, обогащена видами генов, которые действительно помогают нам понять, что взаимодействует с растение или реагирует на фунгициды или опрыскивание фермеров», - сказал Макдауэлл.
Для Хаака самое интересное в результатах этой статьи - доказательство концепции.
У нас есть что-то, называемое архивной базой данных последовательностей, которая полна всевозможных последовательностей с коротким считыванием. Мы действительно можем использовать все эти существующие данные с помощью этой новой технологии, чтобы иметь возможность производить больше геномов такого качества., - сказал Хаак.
Ожидается, что новое поколение технологий Хаака произведет революцию в том, как ученые собирают геномные данные. Благодаря недавно полученным доступным данным в режиме реального времени ученые смогут улучшить предыдущие сборки и быстро создать новые, которые они могут передать в базу данных архивов последовательностей. В более широком масштабе эта технология продвинет вперед область геномики растений и всемирные усилия по спасению растениеводства от разрушительных патогенов.
Теперь, когда у Хаака и Макдауэлла есть примерно 97 процентов генома P. capsici, они планируют использовать эту информацию в качестве вспомогательных данных для двух новых заявок на гранты. Одно предложение будет сосредоточено на болезнях томатов и сои, вызванных патогенами группы Phytophthora, а другое предложение будет сосредоточено на лаванде, еще одной жертве Phytophthora.
Для Хаака этот проект был особенным, потому что он был поддержан грантом Института наук о жизни Фралина в Технологическом институте Вирджинии со средствами, выделенными для поддержки Целевой области глобальных системных наук.
МакДауэлл добавил: «Я думаю, что это говорит об окружающей среде здесь, в Технологическом институте Вирджинии, продвигаемой Fralin, которая позволяет такого рода сотрудничеству объединяться и получать некоторую критическую поддержку на ранней стадии».