Трансферные РНК (тРНК) доставляют определенные аминокислоты к рибосомам во время трансляции матричной РНК в белки. Таким образом, изобилие тРНК может оказывать глубокое влияние на физиологию клеток, но измерение количества каждой тРНК в клетках было ограничено техническими проблемами. Исследователи из Института биохимии Макса Планка преодолели эти ограничения с помощью метода mim-tRNAseq, который можно использовать для количественного определения тРНК в любом организме и который поможет улучшить наше понимание регуляции тРНК в норме и при заболевании.
Клетка содержит несколько сотен тысяч молекул тРНК, каждая из которых состоит всего из 70-90 нуклеотидов, свернутых в виде листьев клевера. На одном конце тРНК несет одну из двадцати аминокислот, которые служат строительными блоками белка, а противоположный конец спаривается с кодоном, определяющим эту аминокислоту в матричной РНК во время трансляции. Хотя для двадцати аминокислот имеется всего 61 кодон, клетки разных организмов могут содержать сотни уникальных молекул тРНК, некоторые из которых отличаются друг от друга всего одним нуклеотидом. Многие нуклеотиды в тРНК также украшены химическими модификациями, которые помогают тРНК складываться или связывать правильный кодон.
Уровни отдельных тРНК динамически регулируются в различных тканях и во время развития, а дефекты тРНК связаны с неврологическими заболеваниями и раком. Молекулярное происхождение этих связей остается неясным, потому что количественная оценка изобилия и модификаций тРНК в клетках долгое время оставалась проблемой. Команда Дэнни Недиалкова из MPI of Biochemistry разработала метод mim-tRNAseq, который точно измеряет количество и статус модификации различных тРНК в клетках.
Препятствия и разрешения модификаций
Для одновременного измерения уровней нескольких РНК ученые используют фермент, называемый обратной транскриптазой, чтобы сначала переписать РНК в ДНК. Миллионы этих копий ДНК могут быть параллельно количественно оценены с помощью высокопроизводительного секвенирования. Переписать тРНК в ДНК было чрезвычайно сложно, поскольку многие модификации тРНК блокируют обратную транскриптазу, заставляя ее прекращать синтез ДНК.
«Многие исследования предложили элегантные решения этой проблемы, но все они устраняют лишь часть препятствий, связанных с модификацией тРНК», - объясняет Дэнни Недиалкова, руководитель исследовательской группы Макса Планка в Институте биохимии Макса Планка. «Мы заметили, что одна конкретная обратная транскриптаза намного лучше читала модифицированные сайты тРНК. Оптимизировав условия реакции, мы смогли значительно повысить эффективность фермента, позволив ему считывать почти все препятствия модификации тРНК», - добавляет Недялкова. Это позволило конструировать библиотеки ДНК из полноразмерных копий тРНК и использовать их для высокопроизводительных последовательность.
Компьютерный инструментарий mim-tRNAseq
Анализ полученных данных секвенирования также представлял значительные трудности. «Мы выявили две основные проблемы: первая - значительное сходство последовательностей между различными транскриптами тРНК», - объясняет Эндрю Беренс, аспирант группы Недиалковой и первый автор статьи. «Второй связан с тем, что неправильный нуклеотид (неправильное включение) вводится во многие модифицированные сайты во время обратной транскрипции. В обоих случаях чрезвычайно сложно соотнести каждую прочитанную ДНК с молекулой тРНК, из которой она произошла», - добавляет Беренс.
Команда решила эти проблемы с помощью новых вычислительных подходов, включая использование аннотаций модификации для точного выравнивания чтения. Полученный комплексный набор инструментов упакован в свободно доступный конвейер для выравнивания, анализа и визуализации данных секвенирования, полученных из тРНК. Исследователи могут использовать mim-tRNAseq не только для измерения количества тРНК, но также для картирования и количественной оценки модификаций тРНК, которые вызывают неправильное включение нуклеотидов обратной транскриптазой. «mim-tRNAseq открывает множество возможностей для продвижения вперед», - говорит Недялкова. «Мы ожидаем, что это поможет нам и другим ответить на многие нерешенные вопросы о биологии тРНК в области здоровья и болезней».