Семейство мембранных белков TMEM16 было провозглашено представителем неуловимых хлоридных каналов, активируемых кальцием. Однако большинство членов семейства оказались скрамблазами, белками, которые перетасовывают липиды между обеими сторонами липидной мембраны, некоторые также обладают неселективной ионной проводимостью. В новом исследовании белков семейства TMEM16 как млекопитающих, так и грибов Кристина Паулино, руководитель отдела крио-ЭМ кафедры структурной биологии Гронингенского университета, Нидерланды, и коллеги из Цюрихского университета, Швейцария, показали, что структуры этих белков говорят об их функциях. Результаты были опубликованы в двух статьях в журнале eLife 12 марта.
Ещё в 1980-х годах учёные обнаружили особые хлоридные каналы, активируемые кальцием. Однако только в 2008 году было обнаружено, что фактическая молекулярная идентичность этих каналов принадлежит семейству TMEM16. «Эти каналы можно использовать для лечения кистозного фиброза - заболевания, при котором нарушается транспортировка хлоридов в легкие и другие органы», - говорит Паулино. Впоследствии в геноме человека было обнаружено десять различных генов TMEM16, но при изучении их функции результат оказался неожиданным. «Два гена действительно кодировали хлоридные каналы, но остальные были скрамблазами - белками, которые перемещают фосфолипиды между обеими сторонами липидного бислоя».
Смерть клетки
Липидный состав клеточных мембран асимметричен: внутренний и внешний монослой содержат разные фосфолипиды. Перемещая специфические фосфолипиды с одной стороны мембраны на другую, скрамблазы нарушают асимметрию.«Это может быть очень сильным сигналом, - объясняет Паулино. «Например, когда липиды, которые обычно находятся внутри мембраны, присутствуют снаружи, это может служить сигналом для индукции гибели клеток. Или, в случае с липидной скрамблазой TMEM16F, инициировать свертывание крови в тромбоцитах». Поэтому строгая регуляция активности скрамблазы имеет жизненно важное значение. Однако, чтобы усложнить ситуацию, некоторые из этих белков скрамблазы также действуют как неселективные ионные каналы.
В качестве постдока в лаборатории Раймунда Дутцлера (теперь ее сотрудника) Паулино решила крио-ЭМ структуру TMEM16A, члена семейства TMEM16, который работает исключительно как канал. Все стало на свои места, когда она сравнила эту структуру с рентгеновской структурой грибковой скрамблазы nhTMEM16: «Оба исследования определили отличительные черты этого бифункционального семейства. Мы могли бы понять, как похожая белковая архитектура может адаптироваться для выполнения этих разных задач. В то время как в структуре липидной скрамблазы мы наблюдали пронизывающую мембрану и доступную через мембрану полость, через которую могут скользить липиды, в структуре хлоридного канала борозда закрыта, образуя пору, которая обеспечивает диффузию ионов через мембрану.'
Scramblases
Однако остались большие вопросы: «Мы хотели знать, как скрамблазы регулируются кальцием и как некоторые из них могут одновременно способствовать переносу ионов». С этой целью ее недавно созданная исследовательская группа в Университете Гронингена вместе с группой Дутцлера в Цюрихе, Швейцария, приступила к изучению белка TMEM16F млекопитающих, который играет решающую роль в свертывании крови. Они решили структуру белка в средах с кальцием и без него, чтобы уловить открытое и закрытое состояние. Однако ни одна из крио-ЭМ структур не показала открытого состояния с полостью, через которую могли бы транспортироваться фосфолипиды и ионы. «Была лишь небольшая разница в структурах с кальцием и без него», - объясняет Паулино..
Есть несколько возможных объяснений: липиды могли транспортироваться без образования водной полости, или экспериментальные условия были просто не оптимальными для того, чтобы белок принял «открытое» состояние. Эффект мутаций в разных местах делал первый вариант маловероятным. Но для прогресса требовалось больше информации. «Поэтому мы решили вернуться к нашим исследованиям грибка nhTMEM16».
Не черно-белое
Эти эксперименты оказались более успешными. Паулино и ее коллеги наблюдали открытое состояние с бороздой, которая могла транспортировать фосфолипиды; закрытое состояние; и промежуточное состояние, которое может обеспечить транспорт ионов. «Действительно, мы обнаружили все три состояния в присутствии кальция, что должно вызывать открытое состояние. Следовательно, наши результаты показывают, что структура очень динамична, с равновесием между различными состояниями». Это также означает, что помимо кальция должен существовать дополнительный фактор, регулирующий активность белков TMEM16, поскольку в клетках активность этих белков жестко регулируется.
Паулино и ее коллеги прошли долгий путь в понимании того, как работают белки семейства TMEM16.«Теперь мы знаем, что это не черно-белая ситуация: множественные конформации белка находятся в динамическом равновесии». В полностью открытом состоянии они являются скрамблазами, а в промежуточном состоянии могут транспортировать ионы. Это говорит о том, что эти белки изначально были скрамблазами, но некоторые из них превратились в чистые ионные каналы, возможно, в результате мутаций, которые благоприятствовали промежуточной форме белка.
Динамика
Потребовалось огромное количество структурных и функциональных данных, чтобы понять сложный механизм действия белков TMEM16. По мнению Паулино, это исследование еще раз подтверждает эффективность крио-ЭМ как исследовательского инструмента: «Это позволило нам замерить динамику активной структуры и увидеть множество различных состояний, в которых может находиться белок».