Измерение токсического воздействия химических соединений на различные типы клеток имеет решающее значение для разработки лекарств от рака, которые должны быть способны убивать клетки-мишени. Анализ выживаемости клеток также является важной задачей в таких областях, как регулирование окружающей среды, для проверки промышленных и сельскохозяйственных химикатов на предмет возможного вредного воздействия на здоровые клетки.
Инженеры-биологи Массачусетского технологического института разработали новый тест на токсичность, который может измерять химическое воздействие на выживаемость клеток с гораздо большей чувствительностью, чем некоторые из самых популярных тестов, используемых сегодня. Это также намного быстрее, чем тест золотого стандарта, который широко не используется, потому что для получения результатов требуется две-три недели. Таким образом, новый тест может помочь фармацевтическим компаниям и ученым-исследователям быстрее выявлять и оценивать новые лекарства.
"Тестирование цитотоксичности является одним из наиболее часто используемых тестов в науках о жизни", - говорит Бевин Энгельворд, профессор биологической инженерии в Массачусетском технологическом институте и старший автор исследования.
Ле Нго, бывший аспирант Массачусетского технологического института и постдок, является ведущим автором статьи, опубликованной в выпуске Cell Reports от 5 февраля. Другие авторы включают Це Кхи Чана, бывшего аспиранта Сингапурско-MIT Alliance for Research and Technology (SMART); Цзин Гэ, бывший аспирант Массачусетского технологического института; и Леона Самсон, соконсультант Нго и почетный профессор биологической инженерии Массачусетского технологического института.
Измерение выживания
Традиционный тест для измерения выживаемости клеток, известный как анализ образования колоний, включает выращивание колоний клеток в чашках для тканевых культур в течение двух-трех недель после воздействия на клетки химического соединения или другого вредного агента, такого как радиация. Затем исследователь подсчитывает количество колоний, чтобы определить, как лечение повлияло на выживаемость клеток.
Часть мотивации Энгельворд для этого исследования была память о долгих часах, которые она провела, подсчитывая такие колонии, будучи аспиранткой.
"Подсчет действительно трудоемкий и мучительно трудный, потому что вы должны постоянно принимать решения относительно того, что является колонией, а что мусором", - говорит она. «Немногие люди больше используют тест на образование колоний, потому что это сложно, слишком медленно и требует огромного количества среды для роста клеток, поэтому вам нужно много тестируемого соединения».
В последние годы ученые начали использовать другие методы, которые являются более быстрыми, но не такими точными и чувствительными, как анализ образования колоний. Эти тесты не измеряют рост клеток напрямую, а анализируют функцию митохондрий.
Энгельворд и его коллеги приступили к разработке теста, который мог бы давать результаты всего за несколько дней, сохраняя при этом точность и чувствительность анализа образования колоний. Изобретенная ими система, которую они назвали MicroColonyChip, состоит из крошечных лунок на пластине. Обработанные и необработанные клетки помещают в эти лунки и начинают формировать очень маленькие колонии в виде сетки. Всего за несколько дней, прежде чем колонии станут видны невооруженным глазом, исследователи могут использовать микроскоп для получения изображения ДНК клеток, которая флуоресцентно помечена.
Изменив код, первоначально разработанный бывшим постдоком Массачусетского технологического института Дэвидом Вудом и профессором Массачусетского технологического института Сангитой Бхатиа, исследователи создали программу, которая измеряет количество флуоресцентной ДНК в каждой лунке, а затем рассчитывает, насколько сильно произошел рост клеток. Сравнивая рост обработанных и необработанных клеток, исследователи могут определить токсичность любого соединения, которое они изучают.
«У нас есть автоматическая система сканирования для создания флуоресцентных изображений, а затем анализ изображения полностью автоматизирован», - говорит Нго.
Исследователи сравнили свой новый тест с золотым стандартом анализа образования колоний и обнаружили, что результаты неотличимы. Им также удалось точно воспроизвести данные о воздействии гамма-излучения на лимфобластоидные клетки человека, собранные 20 лет назад с помощью анализа образования колоний. Используя MicroColonyChip, исследователи получили данные за три дня вместо трех недель.
"Мы смогли воспроизвести исследования радиации 20-летней давности, используя процесс, намного более простой, чем то, что они делали", - говорит Энгелворд.
Большая чувствительность
Исследователи также сравнили свой новый тест с двумя тестами на токсичность, которые чаще всего используются исследователями и фармацевтическими компаниями, известными как XTT и CellTiter-Glo (CTG). Оба эти теста являются косвенными мерами жизнеспособности клеток: XTT измеряет способность клеток расщеплять тетразолий, ключевой этап клеточного метаболизма, а CTG измеряет внутриклеточные уровни АТФ, молекул, которые клетки используют для хранения энергии.
«MicroColonyChip гораздо более чувствителен, чем анализ XTT, поэтому он действительно дает вам возможность увидеть тонкие изменения в выживании клеток, и он так же чувствителен, как анализ CTG, но более устойчив к артефактам», Энгельворд говорит.
Используя новый тест, исследователи изучили эффекты двух повреждающих ДНК препаратов, используемых для химиотерапии, и обнаружили, что они могут точно воспроизводить результаты, полученные с помощью традиционного анализа образования колоний. «Теперь мы планируем расширить эти исследования в надежде продемонстрировать, что тест работает для многих других типов лекарств и клеток», - говорит Нго.
Помимо того, что он полезен для разработки лекарств, этот тест также может быть полезен для органов по регулированию окружающей среды, ответственных за тестирование химических соединений на предмет потенциального вредного воздействия, говорит Энгельворд. Еще одно возможное применение - персонализированная медицина, где его можно использовать для тестирования различных лекарств на клетках пациента перед тем, как будет выбрано лечение.
Исследователи подали заявку на патент на свою технологию. Исследование финансировалось Национальным институтом наук об окружающей среде, включая Программу фундаментальных исследований NIEHS Superfund, и Национальными институтами здравоохранения..