Каждая клетка имеет свой индивидуальный молекулярный отпечаток, который информативен для ее функций и регуляторных состояний. Исследователи из Ludwig-Maximilians-Universitaet (LMU) в Мюнхене провели всестороннее сравнение методологий количественного определения РНК одиночных клеток.
Клетка является основной единицей всех живых организмов. Следовательно, чтобы понять основные биологические процессы и возмущения, вызывающие болезнь, нужно сначала проанализировать функции клеток и механизмы, которые их регулируют. Современные высокопроизводительные методы секвенирования белков и нуклеиновых кислот стали незаменимым компонентом этих усилий. В частности, секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) позволяет определить уровни молекул РНК - копий генов - которые экспрессируются в данной клетке, и в последние годы было описано несколько вариантов методологии. Спектр генов, экспрессируемых в данной клетке, представляет собой молекулярный отпечаток пальца, который дает подробную картину ее текущего функционального состояния. «По этой причине технология стала чрезвычайно ценным инструментом не только для фундаментальных исследований, но и для разработки новых подходов к лечению заболеваний», - говорит биолог LMU Вольфганг Энард. Энард и его команда провели первый всеобъемлющий сравнительный анализ различных методов секвенирования РНК с точки зрения их чувствительности, точности и экономической эффективности. Их результаты опубликованы в ведущем журнале Molecular Cell..
Целью scRNA-seq является определение относительного количества молекул матричной РНК (мРНК), присутствующих в интересующих клетках.мРНК - это чертежи, которые определяют структуры всех белков, образующихся в клетке, и представляют собой «транскрибированные» копии соответствующей генетической информации, закодированной в определенных сегментах геномной ДНК в ядре клетки. В цитоплазме, окружающей ядро, нуклеотидные последовательности мРНК «переводятся» в аминокислотные последовательности белков с помощью молекулярных машин, называемых рибосомами. Таким образом, полный каталог мРНК в клетке дает всестороннее представление о белках, которые она продуцирует, и говорит о том, какое подмножество из тысяч генов в геноме является активным и как регулируется их активность. Более того, аберрантные паттерны генной активности указывают на нарушения экспрессии генов и клеточной функции и выявляют наличие специфических патологий. Сама процедура scRNA-seq может быть выполнена с использованием имеющихся в продаже наборов, но многие исследователи предпочитают самостоятельно собирать компоненты, необходимые для предпочтительных составов.
Чтобы установить, какой из используемых в настоящее время методов является наиболее эффективным и экономичным, Энард и его коллеги применили шесть различных методов к эмбриональным стволовым клеткам мыши и сравнили спектры мРНК, обнаруженные каждым из них. Затем они использовали эти данные, чтобы подсчитать, сколько стоит каждый метод для надежного обнаружения по-разному выраженных генов между двумя типами клеток. «Это сравнение показало, что некоторые из коммерческих комплектов в десять раз дороже, чем соответствующие самодельные версии», - говорит Энард. Однако исследователи отмечают, что выбор оптимального метода во многом зависит от условий и требований конкретного эксперимента. «Очень важно, хотите ли вы анализировать активность сотен генов в тысячах отдельных клеток или тысяч генов в сотнях клеток», - говорит Энард. «Мы смогли продемонстрировать, какой метод лучше всего подходит для той или иной цели, а также получили данные, которые будут полезны для дальнейшего развития технологии."
Новые результаты представляют особый интерес в области геномики. Например, scRNA-seq является фундаментальной предпосылкой успеха усилий по составлению Атласа клеток человека - одного из самых амбициозных международных проектов в области геномики с момента первоначального секвенирования генома человека. Он направлен на то, чтобы предоставить не менее чем полную инвентаризацию всех типов и подтипов клеток в организме человека на всех стадиях развития от эмбриона до взрослого человека на основе их паттернов генной активности. Подсчитано, что общее количество клеток в организме человека составляет порядка 3,5 × 1013. Ученые ожидают, что такой атлас произведет революцию в наших знаниях о биологии человека и в нашем понимании болезненных процессов.