На протяжении более полувека исследования африканской когтистой лягушки (Xenopus laevis) помогали ученым лучше понять биологические основы жизни, от эмбрионального развития и нейробиологии до генетики и болезней. Претензии лягушки на известность включают открытие, удостоенное Нобелевской премии, что судьбу взрослых клеток можно перепрограммировать, и когда-то она служила единственным в мире надежным тестом на беременность.
Теперь новые технологии позволяют ученым узнать еще больше о фундаментальных процессах, которые управляют биологией, из этих доморощенных модельных организмов.
Сообщая в Proceedings of the National Academy of Sciences, группа под руководством системного биолога из Гарвардской медицинской школы Марка Киршнера описывает новый подход к выявлению и измерению изменений в тысячах белков, когда яйца Xenopus подвергаются оплодотворению.
Их исследование раскрывает ранее непрозрачные аспекты молекулярных механизмов, участвующих в оплодотворении, включая детали того, как оплодотворение запускает разрушение небольшого количества белков с низким содержанием, чтобы высвободить «тормоза» клеточного цикла яйцеклетки, и как яйцеклетка быстро высвобождает огромное количество белка, чтобы предотвратить оплодотворение несколькими сперматозоидами.
Результаты позволяют проводить всесторонний анализ динамики белков в клетке в течение узкого промежутка времени, говорят исследователи, что может дать информацию для изучения молекулярного поведения в широком диапазоне биологических систем и помочь пролить свет на клеточные изменения, которые вызывают болезнь.
«Мы разработали метод, который дает нам критически важную возможность количественного определения и измерения абсолютных уровней белков и модификаций белков в динамичной сложной системе», - сказал Киршнер, профессор системной биологии Университета Джона Франклина Эндерса. и заведующий кафедрой системной биологии Гарвардской медицинской школы.
«Метод следует широко использовать во многих биологических и биомедицинских исследованиях», - добавил Киршнер.
Яйца Xenopus использовались в течение десятилетий для изучения молекулярных событий, происходящих во время оплодотворения, проливая свет на клеточный цикл, деление клеток и эмбриональное развитие.
Несмотря на то, что за годы исследований известно многое, ученые до сих пор имеют неполное понимание многих аспектов оплодотворения из-за технических ограничений, в частности, полной картины вовлеченных белков, их функций и того, что происходит с ними с течением времени..
Сканирование штрих-кода
С коллегами Марком Преслером и Элизабет Ван Итали, аспирантами системной биологии Гарвардской медицинской школы, а также Аллоном Кляйном и Стивеном Гиги, профессорами системной биологии и клеточной биологии Гарвардской медицинской школы, Киршнер и исследовательская группа использовали метод маркировки белков яиц Xenopus химическими метками, похожими на штрих-коды, что позволяет ученым одновременно анализировать тысячи белков с помощью масс-спектрометрии.
В сочетании с новой аналитической методологией этот подход позволил команде измерить абсолютные уровни белков в клетке и выявить детали фосфорилирования белка - одной из основных химических модификаций, которые клетки используют для регуляции активности белок.
Проводя измерения во время и в течение 20 минут после оплодотворения, исследователи обнаружили, что уровни небольшого количества белков с низким содержанием быстро падают.
В течение нескольких минут разрушение этих белков вызывает обратное фосфорилирование гораздо более широкого спектра белков по всей клетке - процесс, который способствует завершению клеточного цикла, включая разделение копий хромосом, что подготавливает яйцо к дальнейшему росту.
Хотя только около 0,01 процента от общей белковой массы клетки подверглось деградации, ученые обнаружили, что оплодотворение также вызывает выброс из клетки в 50 раз большего количества белка. По словам исследователей, эти наборы белков, в основном хранящиеся в клеточных компартментах вблизи мембраны, вероятно, секретируются, чтобы помочь предотвратить оплодотворение несколькими сперматозоидами.
Это высвобождение совпадает со значительным всплеском фосфорилирования многочисленных сигнальных и других белков, которые играют роль в генерации волн сокращения на поверхности яйцеклетки сразу после оплодотворения.
Яйцеклетка также выделяет вне клетки несколько белковых ферментов, которые, как подозревают исследователи, помогают блокировать многократное оплодотворение, разрушая белки, связывающие сперму. В несколько парадоксальном открытии команда также наблюдала увеличение белков, которые ингибируют активность ферментов, расщепляющих белок. Причины, однако, остаются неясными и открывают возможности для будущих исследований.
«Мы смогли наблюдать как новые, так и ранее известные особенности клеточного цикла, но мы также смогли распутать другие важные события, происходящие параллельно», - сказал Преслер.«Оплодотворение происходит посредством координации тысяч молекул одновременно, и впервые у нас есть возможность понять это в таком масштабе».
Новая методология позволяет измерять абсолютные уровни белков и фосфорилирования посредством сочетания технологических и математических подходов. Он представляет собой значительное улучшение по сравнению с обычно используемыми крупномасштабными анализами белков, которые могут усложнить точное прогнозирование функциональных различий.
Благодаря значительному повышению детализации и масштаба, в котором ученые могут изучать состав и модификации белков даже в узких промежутках времени, команда считает, что эти методы могут быть применены ко многим биологическим системам.
«Чтобы понять и вылечить болезнь, нам нужно более точное понимание того, что происходит в нормальных, здоровых процессах», - сказал Преслер. «Мы спросили, каковы молекулярные различия между оплодотворенной и неоплодотворенной яйцеклеткой, но этот подход сразу же применим для изучения других важных вопросов, таких как различия между клетками, находящимися в здоровом и болезненном состоянии."
«Биохимия белка определяет большую часть функций клетки, и эта методология может дать нам более полную картину того, как клетки делают то, что они делают», - сказал он.
Дополнительными авторами исследования являются Маргарет Л. Кафлин и Леонид Пешкин с кафедры системной биологии и Райан Кунц с кафедры клеточной биологии Гарвардской медицинской школы; и Мартин Вур из Принстонского университета.