«Направленная эволюция» - это процесс, с помощью которого ученые производят в лаборатории специальные белки для клеточной биологии, физиологии и биомедицины. Основываясь на этом методе, исследователи Макса Планка из Мартинсрида разработали метод оптимизации белков непосредственно в клетках млекопитающих. Используя новый метод, ученые получили флуоресцентный белок mCRISPRred, который ярко флуоресцирует в лизосомах - очень кислых, полностью разлагающихся клеточных везикулах, которые раньше было трудно пометить.
В ходе направленной эволюции белков производится огромное количество слегка измененных вариантов исходного белка. Это создает большой пул потенциальных кандидатов для последующего использования в биомедицинских исследованиях. На втором этапе исследователи отбирают варианты белка с улучшенными желаемыми свойствами. Характеристика подходящих белков-кандидатов происходит в пробирке или в микробных клетках. В целом, процесс очень успешен для многих приложений. Однако варианты белка, которые должны функционировать в специфических условиях клетки млекопитающего или ее органелл, трудно идентифицировать таким образом.
Вместе с коллегами из соседнего Института биохимии им. Макса Планка исследователи из группы Оливера Грисбека разработали новый, основанный на CRISPR-Cas9, метод направленной эволюции белков: «Наша методика не имеет ничего общего с редактированием генома, для которого CRISPR так хорошо известен», - объясняет Арне Фабрициус, один из двух первых авторов исследования.«Мы используем этот метод, чтобы отделить цепь ДНК в определенном месте. Ошибки в механизме репарации затем приводят к генетическому разнообразию - и это происходит непосредственно в живой клетке млекопитающего».
Новый метод вводит ген нужного белка в геном клетки в виде единственной копии. Здесь он стабильно встраивается и передается дочерним клеткам во время клеточного деления. Используя ножницы для гена CRISPR-Cas9, исследователи могут разрезать определенные участки гена встроенного белка. При добавлении специально изготовленных строительных блоков запланированные ошибки, возникающие во время восстановления разреза, могут привести к измененным и, если повезет, к улучшенным вариантам исходного белка.
Таким образом, исследователи из Martinsried разработали белок mCRISPRed, который ярче флуоресцирует при кислом pH в лизосомах и является гораздо более надежным, чем все ранее разработанные белки.
Лизосомы - органоиды клетки, выводящие отходы. Их кислый pH растворяет почти все, с чем они соприкасаются. В течение достаточно долгого времени исследователи искали способ ввести в лизосомы ярко флуоресцирующие белки, чтобы пометить их и тем самым улучшить их исследование внутри клеток.
Недавно разработанный белок mCRISPRed показывает, что свойства белка могут быть адаптированы даже к очень специфическим условиям, таким как лизосомы. «Новое применение CRISPR-Cas9 открывает совершенно другие возможности для развития биосенсоров, рецепторов, терапевтических или сигнальных белков», - с энтузиазмом говорит Оливер Грисбек. «Для меня это определенно следующий шаг в белковой инженерии!»