Аспиранты Миндэ «Джек» Чжэн и Джозеф Шерба разработали новую микрофлюидную платформу для мониторинга электропорации и молекулярной доставки на уровне одной клетки в рамках совместной исследовательской группы под руководством профессоров Джеффри Зана и Дэвида. Шрайбер на кафедре биомедицинской инженерии и профессора Хао Линь и Джерри Шан на кафедре машиностроения и аэрокосмической инженерии в Рутгерсе, Государственный университет Нью-Джерси, в Пискатауэй, штат Нью-Джерси. Электропорация является широко используемым, безопасным, невирусным подходом для доставки чужеродных векторов во множество различных типов клеток. Когда клетка подвергается воздействию электрического поля соответствующей силы, мембрана подвергается обратимому электрическому пробою, при котором в мембране образуются временные поры, обеспечивающие молекулярный транспорт в клетку. Контролируемая внутриклеточная доставка биомолекул и терапевтических средств дает возможность изучать и конструировать фундаментальные клеточные процессы и поэтому является основным направлением биомедицинских исследований и клинической медицины. По данным BioMarket Trends, рынок электропорации в настоящее время представляет собой второй по величине сегмент общего рынка технологий трансфекции стоимостью около 200 миллионов долларов с точки зрения доходов после технологий на основе липидов..
К потребителям на рынке относятся те, кто занимается биомедицинскими исследованиями в академических и отраслевых лабораториях, а также биотехнологические и медико-биологические компании, которые стремятся экспрессировать определенные молекулы в различных клетках. Кроме того, возрос интерес к клиническому использованию технологии трансфекции, особенно с появлением технологии CRISPR для редактирования генов.
Успешная клеточная трансфекция представляет собой ограничивающий этап в многочисленных биомедицинских исследованиях и рабочих процессах биопроизводства, включая клеточную терапию, скрининг интерференции РНК и исследование стволовых клеток. Проблемы включают изменчивую и низкую эффективность трансформации, особенно с трудно трансфицируемыми клеточными линиями, такими как первичные клеточные линии и линии стволовых клеток. Одним из традиционных узких мест электропорации является получение эффективной доставки без ущерба для жизнеспособности клеток. Успешная электропорация включает в себя оптимизацию широкого диапазона параметров электрического поля и буфера, на которые влияет тип клетки и молекулярная полезная нагрузка, для достижения идеального баланса эффективности трансфекции (сколько доставляется) с производимым повреждением (сколько клетки повреждаются или погибают). Протоколы часто определяются путем дорогостоящих проб и ошибок и могут значительно различаться от лаборатории к лаборатории и от приложения к приложению. Междисциплинарная группа исследований и разработок Rutgers сосредоточила свои усилия на трансляционных исследованиях в разработке технологии электропорации следующего поколения для высокоэффективной доставки в клетки с превосходной жизнеспособностью.
Новшеством этого отчета является импедансное определение проницаемости мембраны в условиях непрерывного потока с беспрецедентной чувствительностью, достижение, о котором ранее не сообщалось в литературе. Отслеживая изменения электрических характеристик отдельных клеток при воздействии на них коротких и сильных электрических полей, команда смогла определить, когда клетка стала проницаемой, и определить условия, которые привели к молекулярной доставке при сохранении жизнеспособности клетки. Эта технология ускорит процесс трансфекции, исключив разработку протокола электропорации методом проб и ошибок безопасным и эффективным способом для разных типов клеток и областей применения.
Платформа микроэлектропорации была реализована после обширного теоретического моделирования. Команда разработала и изготовила микрофлюидное устройство, состоящее из конвергентной микрофлюидной «зоны электропорации» и набора электродов, способных как пульсировать в проходящей клетке, так и определять степень пермеабилизации клеточной мембраны. Микрочип для электропорации интегрирован со специально разработанным алгоритмом LabVIEW, который непрерывно отслеживает канал входа клетки в зону электропорации. При обнаружении клетки к ней прикладывается заданный электрический импульс, и электрический сигнал отслеживается на предмет изменений в проницаемости мембраны, что в конечном итоге определяет потенциал терапевтической полезной нагрузки.
Было проведено широко распространенное параметрическое исследование путем изменения как напряженности электрического поля, так и длительности импульса, а также электрического измерения отклика мембранного импеданса сразу после подачи импульса. Степень проницаемости мембраны зависела от интенсивности приложения импульса, при этом значительное увеличение проницаемости происходило при длительности импульса от 0,8 до 1 мс. Эта тенденция также была подтверждена оптическим мониторингом доставки флуоресцентного зонда, йодида пропидия, который непроницаем для клеток с неповрежденными мембранами, но транспортируется в клетку при повреждении мембраны посредством электропорации. Также было показано, что тренды жизнеспособности клеток зависят от силы и продолжительности применяемого импульса.
Двигаясь вперед, команда Rutgers надеется продолжить развитие этой технологии в «умную» автономную систему, которая способна использовать эти электрические сигналы для создания сквозного, управляемого обратной связью уровня одной ячейки. платформа для электропорации. Повышение эффективности трансфекции позволит подходам трансформации клеток на основе электропорации стать более распространенными и вытеснить подходы, основанные на вирусах. Они предполагают линейку продуктов, состоящую из док-станции для базового оборудования и программного обеспечения, которое применяет электрические импульсы и отслеживает проницаемость в режиме реального времени с использованием одноразовых «чипов» для работы с клетками и микрофлюидики. Конечным результатом будет линейка продуктов, которые просты в использовании, воспроизводимы и надежны, что откроет широкий спектр приложений для фундаментальных исследовательских лабораторий, лабораторий разработки и производства в биотехнологическом секторе и, в конечном счете, для клинических учреждений. заинтересованы в прямом редактировании генов или трансфекции для трансплантации и клеточной терапии.