Исследовательская группа из Национальной лаборатории Ок-Риджа Министерства энергетики провела первое в истории прямое наномасштабное исследование мембраны живой клетки. При этом он также разрешил давние дебаты, идентифицировав крошечные группы молекул липидов, которые, вероятно, являются ключевыми для функционирования клетки.
Разработанные методы обеспечивают новую экспериментальную платформу для биофизических исследований мембран и, возможно, других клеточных компонентов. Это может оказаться полезным для будущих исследований важных взаимодействий, таких как лекарство-мембрана, биотопливо-мембрана и даже взаимодействие антибиотик-мембрана.
Мультидисциплинарный проект, возглавляемый биофизиком Джоном Катсарасом, химиком Бобом Стандартом и микробиологом Джеймсом Элкинсом, был выполнен в лабораторном высокопоточном изотопном реакторе и источнике нейтронов расщепления с использованием бактерии Bacillus subtilis. Команда опубликовала свои выводы в журнале PLoS Biology..
Клеточная мембрана представляет собой тонкий двойной слой молекул липидов, среди которых находятся другие биомолекулы, такие как белки. Исследователи не были уверены в том, организуются ли мембранные липиды иногда в группы, называемые доменами, также известными как «плоты», или же они случайным образом распределяются в мембране. Считается, что организация липидов в отдельных доменах внутри клеточной мембраны обеспечивает такие функции, как передача сигналов между клетками.
"Это превратилось в дискуссию", сказал Катсарас. «Некоторые люди верили, что они существуют, в то время как другие считали, что их нет. Было много косвенных доказательств, которые могли бы поддержать любую из сторон».
Проблема заключалась в том, что существующие методики не были способны однозначно решить этот вопрос.
Анализ нейтронного рассеяния был ключом к успеху проекта. Липидные домены слишком малы, чтобы их можно было увидеть в оптические микроскопы, которые используют свет для исследования образцов, таких как биологические клетки. Однако нейтроны не имеют таких ограничений и могут использоваться для получения наномасштабного изображения клетки. Более того, в отличие от других наноинструментов, нейтроны можно использовать для исследования живой клетки, не повреждая ее.
Хотя анализ рассеяния нейтронов преодолел ограничения других технологий, он сам по себе поставил ряд сложных задач. Первый заключался в разработке эксперимента, в котором нейтроны рассеивались на молекулах липидов в мембране, не взаимодействуя с другими компонентами клетки, такими как белки, РНК, ДНК и углеводы. Следующей задачей было отличить один тип липидной молекулы от другого.
Решение обеих этих проблем лежит в использовании дейтерия, изотопа водорода, ядро которого содержит нейтрон, а также протон. Напротив, обычные ядра водорода содержат протон, но не содержат нейтрон. В то время как сама биологическая клетка воспринимает небольшую разницу между обычным водородом и дейтерием, эти два изотопа кажутся очень разными, если рассматривать их с помощью рассеяния нейтронов.
Команда ORNL создала штамм бактерии, содержащий достаточно дейтерия, чтобы сделать клеточные структуры практически невидимыми для нейтронов. Затем они убедились, что молекулы липидов внутри мембраны полностью состоят из двух жирных кислот, содержащих определенные пропорции дейтерия и водорода.
Впоследствии они представили два типа жирных кислот с различным соотношением изотопов. Клеточная мембрана могла свободно создавать и включать в свою мембрану молекулы липидов из них, при этом каждый тип липидов содержал определенную смесь двух изотопов. Если бы липиды были распределены по всей мембране случайным образом, то при воздействии нейтронов мембрана казалась бы однородной, подобно оптическому фону средне-серого цвета.
Если бы, однако, липиды собрались вместе с другими липидами того же типа, фон перестал бы быть однородным и показал бы эквивалент более светлых и более темных серых областей. Собственно, это и обнаружила команда. Серые пятна, обнаруженные с помощью нейтронов, имеют размеры менее 40 нанометров в поперечнике. Сама мембрана имела толщину около 2,4 нанометра.
Исследователи ORNL подчеркнули, что их подход к созданию внутреннего контраста в живых клетках с помощью изотопов был многообещающим и для других исследований, открывая метод направленного дейтерирования другим физическим методам (например, спектроскопии ядерного магнитного резонанса).
«Люди, которые изучают эти вещи, как правило, используют определенные типы зондов», - заметил Катсарас. «Они не использовали рассеяние нейтронов, потому что это не было в рубке биологов. Наш новый экспериментальный подход открывает новые области исследований.
"Например, вы можете использовать модифицированные бактерии в качестве платформы для исследования антибиотиков, потому что многие из этих антибиотиков действительно взаимодействуют с мембраной."