За последние шесть лет инструмент под названием CRISPR-Cas9 изменил генетические исследования, позволив ученым вырезать и редактировать нити ДНК в определенных местах, как крошечные ножницы.
Но иногда для работы требуются не только ножницы. Теперь совместная международная команда представила новый инструмент на основе CRISPR, который больше похож на шредер, способный стирать длинные участки ДНК в клетках человека с программируемым нацеливанием.
Написав на Molecular Cell, они описывают, как им удалось получить другой тип системы CRISPR-Cas под названием CRISPR-Cas3 типа I, который впервые работал в качестве инструмента для редактирования ДНК на большом расстоянии в клетках человека.
Полученный в результате инструмент предоставляет способ нацеливания и удаления гораздо более длинных участков ДНК, чем это позволяют существующие инструменты Cas9. Эта сила может быть использована в генетических исследованиях, чтобы понять основы болезней, и, возможно, в лечении болезней, связанных с длинными участками ДНК..
Ян Чжан, доктор философии, ученый из Мичиганского университета, который руководил исследованием, объясняет, что новый инструмент использует другой тип системы CRISPR, чем широко используемые системы, содержащие Cas9. Оба они заимствованы у бактерий, где они обычно работают, чтобы найти и отсеять вторгшуюся ДНК.
Другой тип CRISPR
Новый инструмент использует CRISPR типа I, который гораздо чаще встречается у бактерий, чем разновидность типа II, включающая Cas9. CRISPR типа I никогда не использовался ни в каких эукариотических клетках и использует рибопротеиновый комплекс, известный как Cascade, для поиска своей мишени и фермент Cas3 для измельчения ДНК.
Сложная часть работы по оптимизации и очистке белка была выполнена в лаборатории профессора Корнельского университета Айлонга Ке, доктора философии. Д., соавтор статьи. Аспирант Корнелльского университета Адам Долан и старший научный сотрудник Университета штата Массачусетс Чжунган Хоу, доктор философии. являются первыми авторами статьи.
В исследовании участвовали Чжан, изучавший бактериальный CRISPR-Cas9 и разработавший инструменты для редактирования генетического материала в клетках человека, и Ке, изучавший CRISPR типа I с использованием структурных и биохимических подходов.
Они намеревались доставить бактериальные компоненты CRISPR в виде белков как в эмбриональные стволовые клетки человека, так и в другой тип клеток, называемый HAP1. С помощью одного руководства CRISPR команде удалось удалить фрагменты целевой ДНК размером от нескольких сотен пар оснований до 100 тысяч оснований.
Моторизованный шредер
Чжан называет систему Cascade-Cas3 «шредером ДНК с мотором», потому что он может перемещаться вдоль генома ДНК на определенное расстояние, разрушая генетический материал по мере его продвижения.
«Cas9 - это молекулярные ножницы, которые идут туда, куда вы хотите, и отрезают один раз», - говорит Чжан, доцент кафедры биологической химии Медицинской школы Университета Мексики.«Но Cas3 идет туда, куда вы хотите, путешествует по хромосоме и создает спектр делеций длиной в десятки тысяч пар оснований. Это может сделать его мощным инструментом скрининга для определения того, какие большие участки ДНК наиболее важны для конкретного заболевания».
Это может быть особенно полезно, когда ученые изучают «некодирующие» длинные участки ДНК, которые не содержат код определенного белка; техника «шредера» может позволить им разрушить последовательность длинных отрезков и посмотреть, что произойдет.
Кроме того, способность Cas3 перемещаться по хромосоме на большие расстояния не может быть достигнута с помощью какой-либо современной техники Cas9. Таким образом, «мертвая по нуклеазе» версия Cas3, которая может перемещаться по ДНК, но лишена функции измельчения, может стать мощной платформой доставки для дальнодействующей эпигеномной инженерии.
Научные вызовы
Часть исследовательской работы заключалась в выяснении того, как заставить человеческие стволовые клетки выявить, была ли удалена какая-либо ДНК, поскольку большинство линий «репортеров» стволовых клеток, разработанных для исследований с участием CRISPR-Cas9, недостаточно чувствительны. если активность измельчения низкая. Сара Хауден, доктор философии. из Университета Мельбурна, Австралия, работал над созданием чувствительной клеточной линии с двумя репортерами.
Еще одной задачей для команды было выяснить, что уничтожил шредер после того, как дело было сделано, используя секвенирование ДНК следующего поколения и выходя за рамки существующих методов, чтобы посмотреть на небольшие изменения, которые производит Cas9.
Хоу разработал метод профилирования на основе транспозаз, а Питер Фреддолино, доктор философии, доцент кафедры биологической химии, вычислительной медицины и биоинформатики в Университете штата Массачусетс, построил специализированные конвейеры информатики для анализа результатов глубокого секвенирования.
Ке также отмечает в статье, что, поскольку направляющая последовательность РНК, необходимая для того, чтобы сообщить «уничтожителю», куда двигаться, длиннее, чем последовательности, используемые в системах CRISPR-Cas9, а также потому, что поиск мишени и ее деградация являются двумя хорошо разделенные шаги, новый метод потенциально лучше контролируется. Это может снизить вероятность ошибочных сокращений там, где они не нужны.
Этот новый инструмент и его производные могут быть полезны в терапевтических целях, полагает Чжан, хотя до такого использования еще далеко.
Сообщалось о некоторых терапевтических применениях на основе CRISPR-Cas9, в том числе спорном редактировании гена рецептора, который позволяет ВИЧ проникать в клетки эмбрионов двух младенцев, родившихся, как сообщается, в Китае. Но также появились опасения по поводу того, что CRISPR-Cas9 внесет непреднамеренные изменения в нормальные участки ДНК пациентов. Потребуется дальнейшая работа, чтобы увидеть, позволяет ли «шредерный» подход избежать этой проблемы.
U-M и Cornell подали заявку на совместный патент на этот новый инструмент. Исследование финансировалось Национальными институтами здравоохранения (GM128637, GM118174, GM102543 и GM117268) и Чжаном в рамках Программы ученых биологических наук Медицинской школы.