Одним из старейших промышленных партнеров человечества являются дрожжи, знакомый микроб, который позволял ранним обществам варить пиво и заквашивать хлеб, а современным синтезировать биотопливо и проводить важные биомедицинские исследования. Дрожжи остаются жизненно важным биологическим агентом, однако наша способность исследовать их геномную активность и влиять на нее отстает.
В новой статье в Nature Communications исследователи Университета Иллинойса описывают успешную интеграцию нескольких передовых технологий - создание стандартизированных генетических компонентов, внедрение настраиваемых инструментов редактирования генома и широкомасштабную автоматизацию молекулярной биологии. лабораторные задания - повысят наши возможности работы с дрожжами. Результаты их нового метода демонстрируют его потенциал для получения ценных новых штаммов дрожжей для промышленного использования, а также для более глубокого понимания генома дрожжей.
"Целью работы на самом деле была разработка инструмента инженерии в масштабе генома для дрожжей… традиционная метаболическая инженерия сосредоточена всего на нескольких генах, а несколько существующих инструментов инженерии в масштабе генома применимы только к бактериям, не эукариотические организмы, такие как дрожжи», - сказал Стивен Л. Миллер, председатель кафедры химической и биомолекулярной инженерии Хуйминь Чжао, который руководил исследованием. «Вторая инновация - это использование концепций синтетической биологии, модульность частей и интеграция с роботизированной системой, поэтому мы можем делать это с высокой пропускной способностью."
Команда сосредоточилась на дрожжах отчасти из-за их важного современного применения; дрожжи используются для преобразования сахаров сырья биомассы в биотопливо, такое как этанол, и промышленные химикаты, такие как молочная кислота, или для разрушения органических загрязнителей. Поскольку дрожжи и другие грибы, как и люди, являются эукариотами, организмами с разделенной клеточной структурой и сложными механизмами контроля активности их генов, изучение функции генома дрожжей также является ключевым компонентом биомедицинских исследований.
«В фундаментальной науке многие аспекты фундаментальной биологии эукариот изучаются на дрожжах», - сказал Тонг Си, научный сотрудник Института геномной биологии им. Карла Р. Вёзе. «Люди имеют ограниченное представление об этих сложных системах. Хотя у дрожжей примерно 6000 генов, люди, вероятно, знают менее 1000 по их функциям; все остальные люди не знают».
Группа сделала первый шаг к своей цели - новой инженерной стратегии для дрожжей, создав то, что известно как библиотека кДНК: коллекция из более чем 90% генов из генома пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), расположенные внутри специального сегмента ДНК, так что каждый ген будет, в одной версии, сверхактивным в дрожжевой клетке, а во второй версии - с пониженной активностью.
Чжао и его коллеги исследовали способность системы CRISPR-Cas, набора молекул, заимствованных из формы иммунной системы у бактерий (CRISPR означает сгруппированные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы, описывающие особенность этой системы у бактерий). геномы). Эта система позволяла Чжао делать точные надрезы в геноме дрожжей, в которые могли вставляться стандартизированные генетические части из их библиотеки.
«В первый раз, когда мы сделали это в 2013 году, не было CRISPR… максимум, что мы могли получить, это 1% клеток, модифицированных за один запуск», - сказал Си. «Мы немного потрудились над этим, и когда вышел CRISPR, это сработало. Мы довели его до 70% [модифицированных клеток], так что это было очень важно».
С помощью частей, модулирующих активность генов, которые интегрируются в геном с такой высокой эффективностью, исследователи смогли случайным образом создать множество различных штаммов дрожжей, каждый со своим уникальным набором модификаций. Эти штаммы были подвергнуты процессам искусственного отбора, чтобы выявить те из них, которые имели желательные признаки, такие как способность выживать при воздействии реагентов, используемых в процессе производства биотоплива..
В этом процессе селекции большую помощь оказала роботизированная система Illinois Biological Foundry for Advanced Biomanufacturing (iBioFAB), которая выполняет большую часть лабораторной работы, описанной выше, в автоматическом режиме, включая отбор перспективных штаммов дрожжей. Использование iBioFAB значительно ускорило работу, позволив одновременно создавать и тестировать множество уникальных штаммов. iBioFAB был задуман и разработан в рамках исследовательской темы «Дизайн биосистем» в Институте геномной биологии Карла Р. Вёзе (IGB), которым руководит Чжао.
При поддержке Группы высокопроизводительных биологических вычислений в Иллинойсе Чжао, Си и их коллеги проанализировали модифицированные геномы своих наиболее многообещающих штаммов дрожжей. Они идентифицировали комбинации генов, измененная активность которых способствовала желаемым чертам; функции некоторых из этих генов ранее были неизвестны, что демонстрирует способность метода генерировать новые биологические знания.
«Я думаю, что ключевое различие между этим методом и другими существующими стратегиями метаболической инженерии в дрожжах действительно заключается в масштабе», - сказал Чжао. «Все современные стратегии метаболической инженерии сосредоточены всего на нескольких генах, максимум на десятках генов… это очень интуитивно понятно. Благодаря этому мы можем исследовать все гены, мы можем идентифицировать множество целей, которые не могут быть интуитивно понятны».