Новое исследование Дж. Уильяма Арендса, профессора микробиологии Иллинойского университета Билла Меткалфа и его научного сотрудника Дипти Наяк, задокументировало использование CRISPR-Cas9-опосредованного редактирования генома в третьем домене жизни, археях, для первый раз. Их новаторская работа, о которой сообщается в Proceedings of the National Academy of Sciences, может значительно ускорить будущие исследования этих организмов с последствиями для исследований, включая глобальное изменение климата. Меткалф и Наяк являются членами Института геномной биологии им. Карла Р. Вёзе в Иллинойсе.
В большинстве случаев у нашей модельной археи, Methanosarcina acetivorans, время удвоения составляет от восьми до десяти часов, по сравнению с E. coli, которая может удвоиться примерно за 30 минут. Это означает, что, занимаясь генетикой, получая для мутанта могут потребоваться месяцы - то же самое для E. coli потребовалось бы три дня», - объясняет Наяк. «Что CRISPR-Cas9 позволяет нам сделать на самом базовом уровне, так это ускорить весь процесс. Он устраняет основное узкое место… в проведении генетических исследований с этим археоном».
«Более того, - продолжает Наяк, - с нашими предыдущими методами мутации нужно было вводить поэтапно. Используя эту новую технологию, мы можем вводить несколько мутаций одновременно. процесс генерации мутантов экспоненциально с CRISPR."
CRISPR, сокращение от Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, началось как система иммунной защиты у архей и бактерий. Идентифицируя и сохраняя короткие фрагменты чужеродной ДНК, белки Cas (CRISPR-ассоциированная система) способны быстро идентифицировать эту ДНК в будущем, чтобы затем ее можно было быстро разрушить, защищая организм от вирусного вторжения.
С момента открытия версия этой иммунной системы - CRISPR-Cas9 - была модифицирована для редактирования геномов в лаборатории. Соединяя Cas9 со специально сконструированным проводником РНК, а не с фрагментом инвазивной ДНК, система CRISPR может быть направлена на разрезание генома клетки в произвольном месте, так что существующие гены могут быть удалены или добавлены новые. Эта система была очень полезна для редактирования эукариотических систем от дрожжей до растений, рыб и даже клеток человека, что принесло ей награду Американской ассоциации содействия развитию науки в 2015 году «Прорыв года». Однако его реализация у прокариотических видов натолкнулась на препятствия, отчасти из-за различий в их клеточных процессах.
Чтобы использовать CRISPR в клеточной системе, исследователи должны разработать протокол, учитывающий предпочитаемый клеткой механизм репарации ДНК: после того, как «молекулярные ножницы» CRISPR разрезают хромосому, система репарации клетки вмешивается, чтобы исправить повреждения через механизм, который можно использовать для удаления или добавления дополнительного генетического материала. В эукариотических клетках это принимает форму негомологичного соединения концов (NHEJ). Хотя этот путь использовался для CRISPR-опосредованного редактирования, он имеет тенденцию вносить генетические ошибки в процессе восстановления: нуклеотиды, ступени лестницы ДНК, часто добавляются или удаляются в месте разреза.
NHEJ очень редко встречается у прокариот, включая архей; вместо этого их ДНК чаще восстанавливается с помощью процесса, известного как репарация, направленная на гомологию. Сравнивая повреждения с шаблоном ДНК, репарация по гомологии создает то, что Наяк называет «детерминированным шаблоном» - конечный результат можно предсказать заранее и адаптировать к точным потребностям исследователя.
Во многих отношениях репарация, направленная на гомологию, на самом деле предпочтительнее для редактирования генома: «Как бы мы ни хотели, чтобы CRISPR-Cas9 выполнял направленные правки в эукариотических системах, мы часто получаем то, что нам не нужно, из-за NHEJ», - объясняет Наяк. «В этом отношении хорошо, что большинство штаммов архей не имеют негомологичной системы репарации соединения концов, поэтому единственный способ репарации ДНК - это детерминированный гомологичный маршрут репарации."
Хотя это может показаться нелогичным, одним из первых применений CRISPR-Cas9 Наяком и Меткалфом было введение механизма NHEJ в Methanosarcina acetivorans. Хотя, как правило, это нежелательно для редактирования генома, говорит Наяк, у NHEJ есть одно применение, в котором он превосходит гомологичную репарацию: «Если вы просто хотите удалить ген, если вам все равно, как… негомологичное соединение концов на самом деле более эффективно.."
Используя введенную систему восстановления NHEJ для проведения так называемых «нокаутных» исследований, в которых один ген удаляется или замалчивается, чтобы увидеть, какие изменения производятся и на какие процессы этот ген может повлиять, Наяк говорит, что будущие исследования позволят составить генетический атлас M. acetivorans и других видов архей. Такой атлас был бы невероятно полезен для различных областей исследований, связанных с археями, включая область, представляющую особый интерес для лаборатории Меткалфа, - изменение климата..
«Methanosarcina acetivorans - один из наиболее генетически податливых штаммов архей», - говорит Наяк.«[Метаногены - это] класс архей, которые ежегодно производят гигатонны этого мощного парникового газа, играют ключевую роль в глобальном углеродном цикле и, следовательно, вносят значительный вклад в глобальное изменение климата». Изучая генетику этого и подобных организмов, Наяк и Меткалф надеются получить более глубокое понимание не только генетики архей, но и их роли в более широких процессах окружающей среды.
В целом, это исследование представляет собой новое захватывающее направление в изучении архей и манипулировании ими. «Мы начали это исследование, чтобы определить, возможно ли использование редактирования генома CRISPR-Cas9 у архей», - заключает Наяк. «Мы обнаружили, что это не только возможно, но и работает на удивление хорошо, даже по сравнению с эукариотическими системами».