С тех пор как в 2012 году была изобретена технология редактирования генома CRISPR, она показала большие перспективы в лечении ряда трудноизлечимых заболеваний. Тем не менее, ученые изо всех сил пытались определить потенциальные нецелевые эффекты в терапевтически значимых типах клеток, что остается основным препятствием для внедрения методов лечения в клинику. Теперь группа ученых из Институтов Гладстона и Института инновационной геномики (IGI) вместе с сотрудниками из AstraZeneca разработала надежный метод именно для этого.
CRISPR редактирует геном человека, вырезая ДНК в определенном месте. Задача состоит в том, чтобы гарантировать, что этот инструмент не сделает надрезы в других частях ДНК - повреждения, называемые «нецелевыми эффектами», которые могут иметь непредвиденные последствия..
В исследовании, которое будет опубликовано завтра в журнале Science, два первых автора, Бик Винерт и Стейсия Вайман, нашли новый подход к проблеме.
«Когда CRISPR делает надрез, ДНК разрывается», - говорит Винерт, доктор философии, который начал работу в лаборатории IGI Джейкоба Э. Корна, а сейчас является докторантом в лаборатории Брюса Р. Конклина в Гладстоне. «Итак, чтобы выжить, клетка рекрутирует множество различных факторов репарации ДНК в этот конкретный участок генома, чтобы исправить разрыв и снова соединить разрезанные концы. Мы подумали, что если бы мы могли найти расположение этих факторов репарации ДНК, мы могли бы определить сайты, которые были вырезаны CRISPR."
Чтобы проверить свою идею, исследователи изучили набор различных факторов репарации ДНК. Они обнаружили, что один из них, названный MRE11, одним из первых откликнулся на место пореза. Используя MRE11, ученые разработали новую технику, названную DISCOVER-Seq, которая может идентифицировать точные участки генома, где был сделан разрез с помощью CRISPR.
«Геном человека чрезвычайно велик - если вы напечатаете всю последовательность ДНК, вы получите роман высотой с 16-этажный дом», - объясняет Конклин, доктор медицинских наук, старший исследователь Gladstone и заместитель директора. в ИГИ. «Когда мы хотим разрезать ДНК с помощью CRISPR, мы пытаемся удалить одно конкретное слово на определенной странице этого романа».
«Вы можете думать о факторах репарации ДНК как о различных типах закладок, добавленных в книгу», - добавляет Конклин. «Хотя некоторые могут добавить в закладки целую главу, MRE11 - это закладка, которая переходит к той букве, которая была изменена».
В настоящее время существуют различные методы обнаружения побочных эффектов CRISPR. Однако они имеют ограничения, которые варьируются от получения ложноположительных результатов до уничтожения исследуемых клеток. Кроме того, наиболее распространенный метод, используемый на сегодняшний день, в настоящее время ограничен использованием культивируемых клеток в лаборатории, за исключением его использования в стволовых клетках, полученных от пациентов, или в тканях животных.
«Поскольку наш метод основан на естественном процессе восстановления клетки для выявления порезов, он оказался гораздо менее инвазивным и гораздо более надежным», - говорит Корн, доктор философии, который сейчас руководит лабораторией в ETH Zurich. «Мы смогли протестировать наш новый метод DISCOVER-Seq на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, клетках пациентов и мышах, и наши результаты показывают, что этот метод потенциально может быть использован в любой системе, а не только в лаборатории».
Метод DISCOVER-Seq, примененный к новым типам клеток и системам, также открыл новое понимание механизмов, используемых CRISPR для редактирования генома, что приведет к лучшему пониманию биологии того, как это происходит. инструмент работает.
«Новый метод значительно упрощает процесс выявления нецелевых эффектов, а также повышает точность результатов», - говорит Конклин, который также является профессором медицинской генетики и молекулярной фармакологии в Калифорнийском университете в Сан-Франциско (UCSF).. «Это может позволить нам лучше предсказывать, как редактирование генома будет работать в клинических условиях. В результате это представляет собой важный шаг в улучшении доклинических исследований и приближении терапии на основе CRISPR к нуждающимся пациентам».