Микробы могут быть сконструированы для производства различных полезных соединений, включая пластмассы, биотопливо и фармацевтические препараты. Однако во многих случаях эти продукты конкурируют с метаболическими путями, которые необходимы клеткам для самообеспечения и роста.
Чтобы помочь оптимизировать способность клеток производить нужные соединения, а также поддерживать их собственный рост, инженеры-химики Массачусетского технологического института разработали способ заставить бактерии переключаться между различными метаболическими путями в разное время. Эти переключатели запрограммированы в клетках и срабатывают при изменении плотности населения без вмешательства человека.
«Мы надеемся, что это позволит более точно регулировать метаболизм, что позволит нам повысить производительность, но таким образом, чтобы минимизировать количество вмешательств», - говорит Кристала Пратер, Артур Д. Маленький профессор химического машиностроения и старший автор исследования.
Такое переключение позволило исследователям повысить микробную продуктивность двух разных продуктов до десяти раз.
Аспирант Массачусетского технологического института Кристина Дин является ведущим автором статьи, опубликованной на этой неделе в Proceedings of the National Academy of Sciences.
Двойной переключатель
Чтобы заставить микробы синтезировать полезные соединения, которые они обычно не производят, инженеры вставляют гены ферментов, участвующих в метаболическом пути - цепи реакций, в результате которых образуется определенный продукт. Этот подход сейчас используется для производства многих сложных продуктов, таких как фармацевтические препараты и биотопливо.
В некоторых случаях промежуточные продукты, образующиеся в ходе этих реакций, также являются частью метаболических путей, которые уже существуют в клетках. Когда клетки отвлекают эти промежуточные продукты от сконструированного пути, это снижает общий выход конечного продукта.
Используя концепцию, называемую динамической метаболической инженерией, Пратер ранее построил переключатели, которые помогают клеткам поддерживать баланс между их собственными метаболическими потребностями и путем, производящим желаемый продукт. Ее идея заключалась в том, чтобы запрограммировать клетки на автономное переключение между путями без необходимости какого-либо вмешательства со стороны человека, управляющего ферментером, в котором происходят реакции.
В исследовании, опубликованном в 2017 году, лаборатория Пратера использовала этот подход для программирования E. coli для производства глюкариновой кислоты, прекурсора таких продуктов, как нейлон и моющие средства. Стратегия исследователей была основана на ощущении кворума - явлении, которое бактериальные клетки обычно используют для общения друг с другом. Каждый вид бактерий выделяет определенные молекулы, которые помогают им чувствовать близлежащие микробы и влиять на поведение друг друга.
Команда Массачусетского технологического института сконструировала свои клетки E. coli так, чтобы они выделяли молекулу, определяющую кворум, называемую AHL. Когда концентрации АГЛ достигают определенного уровня, клетки отключают фермент, который направляет предшественник глюкариновой кислоты на один из собственных метаболических путей клеток. Это позволяет клеткам нормально расти и делиться до тех пор, пока популяция не станет достаточно большой, чтобы начать производить большое количество желаемого продукта.
«Этот документ был первым, кто продемонстрировал, что мы можем осуществлять автономное управление», - говорит Пратер. «Мы могли бы начать работу с культурами, и тогда клетки почувствовали бы, когда пришло время внести изменения».
В новой статье PNAS Пратер и Дин поставили перед собой цель внедрить несколько точек переключения в свои ячейки, что дало бы им большую степень контроля над производственным процессом. Для этого они использовали две системы определения кворума из двух разных видов бактерий. Они включили эти системы в кишечную палочку, которая была разработана для производства соединения под названием нарингенин, флавоноида, который естественным образом содержится в цитрусовых и оказывает множество полезных эффектов на здоровье.
Используя эти системы определения кворума, исследователи создали в ячейках две точки переключения. Один переключатель был разработан, чтобы предотвратить отвлечение бактериями предшественника нарингенина, называемого малонил-КоА, в собственные метаболические пути клеток. В другой точке переключения исследователи задержали выработку фермента в своем инженерном пути, чтобы избежать накопления предшественника, который обычно ингибирует путь нарингенина, если накапливается слишком много предшественника.
«Поскольку мы взяли компоненты из двух разных систем распознавания кворума, а белки-регуляторы уникальны для этих двух систем, мы можем сдвигать время переключения каждой из цепей независимо друг от друга», - говорит Дин.
Исследователи создали сотни штаммов E.coli, которые выполняют эти два переключения при разной плотности популяции, что позволяет им определить, какой из них был наиболее продуктивным. Наиболее продуктивный штамм показал десятикратное увеличение выхода нарингенина по сравнению со штаммами, не имеющими встроенных переключателей управления.
Более сложные пути
Исследователи также продемонстрировали, что подход с множественными переключениями можно использовать для удвоения производства салициловой кислоты E. coli, строительного блока многих лекарств. По словам Пратера, этот процесс также может помочь повысить выход любого другого типа продукта, когда клеткам приходится балансировать между использованием промежуточных продуктов для образования продукта или их собственным ростом. Исследователи еще не продемонстрировали, что их метод работает в промышленных масштабах, но они работают над расширением подхода к более сложным путям и надеются протестировать его в большем масштабе в будущем.
«Мы думаем, что это определенно имеет более широкое применение», - говорит Пратер.«Процесс очень надежен, потому что он не требует присутствия кого-то в определенный момент времени, чтобы что-то добавить или внести какие-либо коррективы в процесс, а скорее позволяет клеткам внутренне отслеживать, когда пришло время сделай смену."
Исследование финансировалось Национальным научным фондом.