Представьте, что вы берете мазок из ноздрей, кладете мазок в устройство и через 15-30 минут получаете на свой телефон данные о том, заражены ли вы вирусом COVID-19. Таково видение группы ученых из Gladstone Institutes, Калифорнийского университета в Беркли (UC Berkeley) и Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF). И теперь они сообщают о научном прорыве, приближающем их к воплощению этого видения в реальность.
Одним из основных препятствий на пути борьбы с пандемией COVID-19 и полного открытия сообществ по всей стране является доступность массового экспресс-тестирования. Знание того, кто заражен, даст ценную информацию о потенциальном распространении и угрозе вируса как для политиков, так и для граждан.
Тем не менее, людям часто приходится ждать результатов несколько дней, а то и дольше, если есть задержки в обработке лабораторных анализов. И ситуация усугубляется тем фактом, что большинство инфицированных людей имеют легкие симптомы или вообще не имеют симптомов, но все же являются переносчиками и распространителями вируса.
В новом исследовании, опубликованном в научном журнале Cell, команда из Гладстона, Калифорнийского университета в Беркли и Калифорнийского университета в Сан-Франциско описала технологию теста на COVID-19 на основе CRISPR, в котором для получения точных результатов используется камера смартфона. до 30 минут.
«Научному сообществу было неотложной задачей не только увеличить количество тестов, но и предоставить новые возможности тестирования», - говорит Мелани Отт, доктор медицинских наук, директор Института вирусологии Гладстона и один из руководители исследования.«Разработанный нами анализ может обеспечить быстрое и недорогое тестирование, чтобы помочь контролировать распространение COVID-19».
Техника была разработана в сотрудничестве с биоинженером Калифорнийского университета в Беркли Дэниелом Флетчером, доктором философии, а также Дженнифер Дудна, доктором философии, которая является старшим исследователем в Гладстоне, профессором Калифорнийского университета в Беркли, президентом Института инновационной геномики и исследователь Медицинского института Говарда Хьюза. Дудна недавно получил Нобелевскую премию по химии 2020 года за совместное открытие технологии редактирования генома CRISPR-Cas, лежащей в основе этой работы.
Мало того, что их новый диагностический тест может давать положительный или отрицательный результат, он также измеряет вирусную нагрузку (или концентрацию SARS-CoV-2, вируса, вызывающего COVID-19) в данном образце.
«В сочетании с повторным тестированием измерение вирусной нагрузки может помочь определить, увеличивается или уменьшается инфекция», - говорит Флетчер, который также является исследователем Chan Zuckerberg Biohub.«Наблюдение за течением инфекции у пациента может помочь медицинским работникам оценить стадию инфекции и предсказать в режиме реального времени, сколько времени, вероятно, потребуется для выздоровления».
Упрощенный тест с помощью прямого обнаружения
Текущие тесты на COVID-19 используют метод, называемый количественная ПЦР - золотой стандарт тестирования. Однако одна из проблем использования этого метода для тестирования на SARS-CoV-2 заключается в том, что для этого требуется ДНК. Коронавирус - это РНК-вирус, а это означает, что для использования метода ПЦР вирусная РНК должна быть сначала преобразована в ДНК. Кроме того, этот метод основан на двухстадийной химической реакции, включая стадию амплификации, чтобы получить достаточно ДНК, чтобы ее можно было обнаружить. Таким образом, современные тесты обычно требуют обученных пользователей, специализированных реагентов и громоздкого лабораторного оборудования, что сильно ограничивает возможности проведения тестирования и приводит к задержкам в получении результатов.
В качестве альтернативы ПЦР ученые разрабатывают стратегии тестирования, основанные на технологии редактирования генов CRISPR, которая отлично подходит для специфической идентификации генетического материала.
Все средства диагностики CRISPR на сегодняшний день требуют, чтобы вирусная РНК была преобразована в ДНК и амплифицирована, прежде чем ее можно будет обнаружить, что увеличивает время и сложность. Напротив, новый подход, описанный в этом недавнем исследовании, пропускает все этапы преобразования и амплификации, используя CRISPR для прямого обнаружения вирусной РНК.
«Одна из причин, по которой мы в восторге от диагностики на основе CRISPR, - это возможность получения быстрых и точных результатов в момент необходимости», - говорит Дудна. «Это особенно полезно в местах с ограниченным доступом к тестированию или когда необходимо частое быстрое тестирование. Это может устранить многие узкие места, которые мы видели с COVID-19».
Париназ Фозуни, аспирант Калифорнийского университета в Сан-Франциско, работавший в лаборатории Отта в Гладстоне, последние несколько лет работал над системой обнаружения РНК ВИЧ. Но в январе 2020 года, когда стало ясно, что коронавирус становится все более серьезной проблемой во всем мире и что тестирование может стать потенциальной ловушкой, она и ее коллеги решили переключить свое внимание на COVID-19.
«Мы знали, что анализ, который мы разрабатывали, будет логично подходить для помощи в кризисной ситуации, позволяя проводить быстрое тестирование с минимальными ресурсами», - говорит Фозуни, который является соавтором статьи вместе с Сонмином Соном и Марией. Диас де Леон Дерби из команды Флетчера в Калифорнийском университете в Беркли. «Вместо хорошо известного белка CRISPR под названием Cas9, который распознает и расщепляет ДНК, мы использовали Cas13, который расщепляет РНК».
В новом тесте белок Cas13 сочетается с репортерной молекулой, которая становится флуоресцентной при разрезании, а затем смешивается с образцом пациента из мазка из носа. Образец помещается в устройство, которое подключается к смартфону. Если образец содержит РНК SARS-CoV-2, Cas13 активируется и разрезает репортерную молекулу, вызывая испускание флуоресцентного сигнала. Затем камера смартфона, по сути превращенная в микроскоп, может обнаружить флуоресценцию и сообщить, что мазок дал положительный результат на вирус.
«Что действительно делает этот тест уникальным, так это то, что он использует одноэтапную реакцию для прямого тестирования вирусной РНК, в отличие от двухэтапного процесса в традиционных тестах ПЦР», - говорит Отт, который также является профессором. на медицинском факультете UCSF.«Более простая химия в сочетании с камерой смартфона сокращает время обнаружения и не требует сложного лабораторного оборудования. Это также позволяет тесту давать количественные измерения, а не просто положительный или отрицательный результат».
Исследователи также говорят, что их анализ может быть адаптирован к различным мобильным телефонам, что делает технологию легкодоступной.
«Мы решили использовать мобильные телефоны в качестве основы для нашего устройства обнаружения, поскольку они имеют интуитивно понятный пользовательский интерфейс и высокочувствительные камеры, которые мы можем использовать для обнаружения флуоресценции», - объясняет Флетчер. «Мобильные телефоны также выпускаются серийно и экономичны, что свидетельствует о том, что для этого анализа не нужны специализированные лабораторные инструменты».
Точные и быстрые результаты для ограничения пандемии
Когда ученые протестировали свое устройство на образцах пациентов, они подтвердили, что оно может обеспечить очень быстрое получение результатов для образцов с клинически значимой вирусной нагрузкой. Фактически, устройство точно обнаружило набор положительных образцов менее чем за 5 минут. Для образцов с низкой вирусной нагрузкой устройству требовалось до 30 минут, чтобы отличить ее от отрицательного теста.
«Последние модели SARS-CoV-2 предполагают, что частое тестирование с быстрым временем выполнения - это то, что нам нужно для преодоления нынешней пандемии», - говорит Отт. «Мы надеемся, что с усилением тестирования мы сможем избежать блокировок и защитить наиболее уязвимые группы населения».
Новый тест на основе CRISPR не только предлагает многообещающий вариант для быстрого тестирования, но благодаря использованию смартфона и избежанию необходимости в громоздком лабораторном оборудовании он может стать портативным и, в конечном итоге, доступным для точечного тестирования. ухода или даже домашнего использования. Кроме того, его можно расширить для диагностики других респираторных вирусов помимо SARS-CoV-2.
Кроме того, высокая чувствительность камер смартфонов вместе с их возможностью подключения, GPS и Отт говорит. «Этот тип диагностического теста на основе смартфона может сыграть решающую роль в борьбе с нынешней и будущей пандемией».
Об исследовательском проекте
Исследование под названием «Обнаружение SARS-CoV-2 без амплификации с помощью CRISPR-Cas13a и микроскопии мобильного телефона» было опубликовано на сайте Cell 4 декабря 2020 года.
Другими авторами исследования являются Гэвин Дж. Нотт, Майкл В. Д'Амброзио, Абдул Бхуйя, Макс Армстронг и Эндрю Харрис из Калифорнийского университета в Беркли; Карли Н. Грей, Г. Ренука Кумар, Стефани И. Стивенс, Даниэла Бём, Чиа-Лин Цоу, Джеффри Шу, Жаннетт М. Остерлох, Анке Мейер-Франке и Кэтрин С. Поллард из Институтов Гладстона; Чунью Чжао, Эмили Д. Кроуфорд, Андреас С. Пушник, Майра Фелпс и Эми Кистлер из Биохаба Чана Цукерберга; Нил А. Свитц из Университета штата Сан-Хосе; и Чарльз Ланжелье и Джозеф Л. ДеРизи из Калифорнийского университета в Сан-Франциско.
Исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения (грант NIAID 5R61AI140465-03 и грант NIDA 1R61DA048444-01); программа NIH Rapid Acceleration of Diagnostics (RADx); Национальный институт сердца, легких и крови; Национальный институт биомедицинской визуализации и биоинженерии; Департамент здравоохранения и социальных служб (грант No.3У54ХЛ143541-02С1); а также благодаря благотворительной поддержке Fast Grants, Благотворительного фонда Джеймса Б. Пендлтона, Фонда Родденберри и нескольких отдельных доноров. Эта работа также стала возможной благодаря щедрому подарку от анонимного частного донора в поддержку консорциума диагностики ANCER.