Система CRISPR/Cas9 вызвала волну возмущения в научном сообществе с тех пор, как ее механизмы были предложены в 2012 году. Обычно ее называют инструментом редактирования генома. Cas9-белок. Исследователи из Института генетики растений и исследований сельскохозяйственных культур им. Лейбница (IPK Gatersleben) нашли способ использовать комплекс РНК/белок немного по-другому - в качестве цитогенетического факела. В отличие от обычной гибридизации in situ, новая РНК-управляемая эндонуклеаза - инструмент для мечения in situ (RGEN-ISL) больше не требует денатурации ДНК. Таким образом, новый метод оставляет хроматин нетронутым, что позволяет исследовать структуру образца. Более того, RGEN-ISL можно комбинировать с методами обнаружения белков, что позволяет визуализировать процесс мечения в реальном времени. Хотя RGEN-ISL изначально разрабатывался для геномов растений, его можно использовать во всех организмах, и он показал себя как многообещающий новый инструмент в области биологии хромосом.
Открытие системы каспазы 9 (Cas9), ассоциированной с регулярно расположенными кластерами коротких палиндромных повторов типа II (CRISPR), стало важной вехой в области целенаправленного редактирования генома. Первоначально полученный из бактерии Streptococcus pyogenes, комплекс РНК/белок теперь является признанным инструментом для целенаправленного редактирования генома у эукариот.
Хотя его свойства, подобные ножницам, нашли широкое применение, ученые из Института генетики растений и исследований сельскохозяйственных культур им. Лейбница (IPK Gatersleben) теперь используют CRISPR/Cas9 в новом цитогенетическом методе, чтобы пролить свет в геномы эукариот - РНК-управляемая эндонуклеаза - мечение in situ (RGEN-ISL).
В течение последних 30 лет флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) была признанным и широко используемым методом визуализации последовательностей ДНК in situ на хромосомном уровне. Однако этот метод требует денатурации исследуемой ДНК, что часто приводит к повреждению структуры образца. Основав метод RGEN-ISL на CRISPR-Cas9, исследователям IPK удалось обойти стадию денатурации FISH, одновременно интегрировав желаемые свойства флуоресцентного мечения обычного метода FISH. Поскольку новый цитогенетический инструмент сохраняет структуру образца, он открывает возможность исследования пространственно-временной структуры генома.
Дальнейшие эксперименты показали, что RGEN-ISL превосходит обычные комбинации методов, такие как FISH и иммуногистохимия, требуя меньше подготовки и будучи сравнительно быстрее и дешевле. Кроме того, новый метод работает в широком диапазоне температур от 4°C до 37°C, а также может сочетаться с дополнительными методами обнаружения и визуализации белков. Еще одним преимуществом является то, что RGEN-ISL позволяет визуализировать в реальном времени мечение ДНК, опосредованное CRISPR/Cas9, таким образом раскрывая кинетику реакции.
До сих пор исследователи тестировали RGEN-ISL на образцах растений, а также на человеческих хромосомах, показывая, что их новый метод, вероятно, может быть применен ко всем организмам. В настоящее время использование метода ограничено повторяющимися последовательностями ДНК, которые часто встречаются в геномах растений. Однако доктор Такаёси Исии, работающий в настоящее время в Университете Тоттори (Япония), автор первоначальной идеи RGEN-ISL, предполагает, что в будущем этот метод можно будет адаптировать для визуализации даже однокопийных последовательностей.
Проект вокруг нового метода, который был разработан под руководством руководителя исследовательской группы доктора Андреаса Хубена, стал возможным благодаря гранту CSIRO (Австралия) Фонда Билла и Мелинды Гейтс (США), а также благодаря дополнительным финансирование Немецкого исследовательского фонда - DFG (Германия).
Благодаря своим свойствам и широкой применимости, RGEN-ISL является многообещающим новым цитогенетическим инструментом для дальнейшего понимания пространственной организации генома и связи между структурой и функцией хроматина, а также для расширения знаний в рамках Широкая область хромосомной биологии.