Понимание того, как устроены каркасы антибиотиков в природе, может помочь ученым искать новые классы антибиотиков с помощью секвенирования ДНК и анализа генома. Исследователи использовали эти знания, чтобы помочь определить рентгеновскую кристаллическую структуру фермента, который производит обафторин - антибиотик широкого спектра действия, вырабатываемый флуоресцентным штаммом почвенных бактерий. Новая работа Вашингтонского университета в Сент-Луисе и Университета в Буффало опубликована 31 июля в журнале Nature Communications.
Составной фермент, называемый нерибосомальной пептидной синтетазой, производит высокореактивное бета-лактоновое кольцо, ответственное за антимикробную активность обафторина.
«Обафторин имеет новую структуру по сравнению со всеми антибиотиками, одобренными FDA», - сказал Тимоти Венцевиц, доцент кафедры химии в области искусств и наук. «В долгосрочной перспективе нам действительно нужны новые структурные классы антибиотиков, которые никогда не были заражены клинической резистентностью установленных классов антибиотиков».
Эти химические вещества могут быть использованы в качестве антибиотиков нового поколения для людей или даже в интересах сельскохозяйственного сектора, отметил Венцевиц, поскольку исследователи стремятся разработать средства для обработки семян и биопестициды для поддержки систем растений, способных производить достаточно пищи, чтобы накормить По прогнозам, к 2050 году на этой планете будет жить 9,6 миллиарда человек.
Новая работа представляет собой полезную дорожную карту, которая показывает, как отдельные белковые домены в ферменте ObiF1 сшиваются вместе в трехмерном пространстве. Структура фермента лежит в основе почти всех функций, которые он выполняет.
«Разгадка этой структуры расширяет предыдущие открытия, чтобы по-новому взглянуть на молекулярные взаимодействия между каталитическими доменами», - сказал Эндрю М. Гулик, доцент кафедры структурной биологии в Школе Джейкобса. Медицины и биомедицинских наук в Университете Буффало. «Это совершенно новый класс соединений, и у нас никогда не было молекулярного зрения, чтобы понять, как они производятся».
Открытие нового природного антибиотика
Обафлуорин вырабатывается флуоресцентным штаммом почвенных бактерий, образующих биопленки на корнях растений. Обафторин был первоначально открыт в 1984 году, но только в 2017 году Венцевиц раскрыл генетический план фермента, из которого состоят биологически активные компоненты молекулы. Это открытие ознаменовало собой первый случай, когда кому-либо удалось выделить из природы фермент, образующий бета-лактон, и воссоздать его в лаборатории..
Как и пенициллин, обафторин имеет четырехчленное кольцо, которое иногда называют заколдованным кольцом. Четырехчленное кольцо создает нагрузку на валентные углы, которые предпочитает принимать углерод. Но поскольку четырехчленное кольцо нестабильно, эти молекулы недолговечны, и их трудно получить. Например, химикам потребовались годы, чтобы научиться синтезировать пенициллин из химических веществ, а затем выяснить, как его производят грибы. В конечном итоге это привело к глобальному производству пенициллина методом ферментации.
Исследователи в лаборатории Венцевича смогли ускорить процесс открытия, используя генетику, чтобы сосредоточиться на биосинтетическом механизме, который бактерии используют для производства обафторина, а затем реконструировать этот многоступенчатый ферментативно-катализируемый процесс в организме. лаборатория.
Пойман 'с поличным'
В своей новой работе Венцевиц и Гулик вместе с постдокторантом Дейлом Ф. Крейтлер (UB) и аспиранты Джейсон Э. Шаффер и Эрин М. Геммелл (Вашингтонский университет) нанесли на карту полноразмерную нерибосомальную пептидную синтетазу (NRPS), которая образует биоактивные компоненты обафторина.
Гулик является экспертом по системам NRPS и опубликовал многие исходные кристаллические структуры основных частей этих ферментов, а также структуры полноразмерных систем, таких как та, что представлена в этой работе.
Результатом является комплексная, подробная молекулярная структура с разрешением 3 Ангстрема, которая позволяет идентифицировать атомы в белковой цепи, видеть их расположение и точки контакта вдоль цепи, а также определять, как части собираются для производства полезные молекулы от начала до конца.
«Мы смогли уловить некоторые из строительных блоков молекул, захваченных внутри некоторых ферментативно-активных участков - в процессе выполнения химии», - сказал Венцевиц. «Это помогло нам соединить небольшие молекулы с белком и заполнить некоторые механистические пробелы в том, как создаются молекулы."
Этот тип взгляда особенно важен для будущей цели создания химической библиотеки, наполненной родственными соединениями бета-лактона, которые были разработаны для полезного использования.
«Мы также получили очень интересное представление о том, как домены белка на самом деле взаимодействуют друг с другом», - сказал Венцевиц. Кристаллические структуры позволили им увидеть, как ключевые компоненты фермента стыкуются друг с другом и как молекулы эффективно перемещаются по всей линии сборки NRPS.
Один конкретный компонент - то, что называется MbtH-подобным белком, или MLP, потому что он был впервые идентифицирован в родственной системе для производства микобактина в бактериях, вызывающих туберкулез, - как было показано, играет решающую роль в облегчении белково- белок-взаимодействия между каталитическими доменами.
«Оказывается, (общий) белок в значительной степени страдает, когда вы убираете этот очень маленький белок, который обеспечивает критическое рукопожатие», - сказал он.«Это показало нам раз и навсегда, что координация этих доменов абсолютно важна для функции создания антибиотиков с помощью этого фермента».
В целом новая статья уникальна по своему охвату, заявили исследователи, представляя рентгеновскую кристаллическую структуру полного фермента, синтезирующего обафторин, ObiF1, исследуя молекулярный механизм различных ключевых стадий каталитического процесса. цикл и установление консервативных остатков, которые обеспечивают образование реакционноспособного бета-лактонового кольца.
Ключевой шаг в долгом процессе
Поиск антибиотика из природного источника - это только первый шаг в долгом процессе разработки лекарств. Благодаря структуре и методам, изложенным в этой новой статье, теперь можно быстро и легко создавать аналоги натурального продукта в лаборатории, чтобы оптимизировать его молекулярные свойства и биологическую активность.
Гулик и Венцевиц планируют продолжать применять свои знания о пути биосинтеза обафторина для открытия новых натуральных продуктов бета-лактона с использованием геномных и биохимических подходов.
«Учитывая структурное разнообразие известных натуральных продуктов бета-лактона, мы считаем, что новые синтезы бета-лактона еще предстоит открыть», - сказал Венцевиц..
Вашингтонский университет подал заявку на патент США на полезную технологию, охватывающую эту технологию.