Наши клетки перемещают энергию и материю туда, где они необходимы. Но как они делают это в реальном времени и с точки зрения отдельной молекулы? Датская исследовательская группа успешно открыла новые базовые знания об этом невидимом мире, проведя эксперименты, которые отслеживают, как работает одна молекула белкового «двигателя», известного как кальциевый насос..
Впервые появилась возможность непосредственно взглянуть на один из самых фундаментальных механизмов организма: ионные насосы, питающие транспортную и сигнальную системы клетки. Эти функции лежат в основе биомолекулярных механизмов, имеющих решающее значение для вас, меня и любого другого живого существа.
Кальциевая помпа может выглядеть не так уж и много. Каждый насос измеряет всего несколько нанометров, миллионных долей миллиметра в каждом направлении и находится в клеточных мембранах нашего тела. Но, несмотря на свои миниатюрные размеры, он имеет решающее значение для жизни. Этот насос является причиной того, что наши мышцы могут сокращаться, а нейроны могут посылать сигналы. Если крошечный насос перестанет работать, клетки перестанут общаться. Без него мы не могли бы ни двигаться, ни думать. Вот почему клетки используют так много своей энергии - около четверти топлива организма, известного как АТФ, - чтобы поддерживать работу насосов.
Есть много вещей, которые мы до сих пор не знаем о структуре и функциях этого жизненно важного насоса. Знание о насосе необходимо для понимания энергетического баланса и других важных функций в организме.
Датская исследовательская группа только что опубликовала новое исследование, в котором впервые показано, как работает насос на уровне одной молекулы и как он обеспечивает перекачку ионов в правильном направлении. Другими словами, как насос работает как молекулярная улица с односторонним движением. Открытие только что было опубликовано в журнале Nature.
Эта работа представляет собой следующий шаг в глубоком и важном стремлении понять атомную структуру и функцию насоса. Теперь мы на один шаг ближе к пониманию того, как ионные насосы обеспечивают функции клеток. Мы охарактеризовали, как он выкачивает ионы из клетки с беспрецедентным уровнем детализации. Важность таких базовых знаний о биофизических процессах можно только недооценивать. Это окажет большое влияние на наше понимание жизненных процессов и, со временем, на лечение болезней. », - говорит профессор Пол Ниссен, глава Центра передового опыта PUMPkin и центра нейробиологии DANDRITE. Профессор Ниссен является одним из ведущих мировых экспертов по этому семейству насосов и соавтором статьи.
Молекулярная опора
В какой-то степени история началась в 1950-х годах, когда профессор Йенс Кристиан Скоу провел свою новаторскую работу в Орхусском университете, которая открыла насосные функции в наших клетках. Кальциевая помпа является близким родственником натрий-калиевой помпы, над которой работал Скоу, и они используют аналогичный насосный механизм. Работа Скоу принесла ему Нобелевскую премию по химии в 1997 году. С тех пор многие исследователи посвятили свою трудовую жизнь раскрытию механизма и функции этих насосов, в том числе многие в Центре передового опыта по мембранным насосам в клетках и заболеваниях, PUMPkin, в Орхусский университет.
Ключевая идея новой публикации касается одностороннего характера переноса ионов. Ранее предполагалось, что односторонний характер накачки возникает при расщеплении богатой энергией молекулы АТФ. Гипотеза заключалась в том, что когда АТФ расщепляется, насос не может вернуться и восстановить АТФ. Это оказалось далеко не так:
Мы определили новое закрытое состояние в насосном цикле, в которое насос может войти только в том случае, если ион кальция поступает из внутриклеточной жидкости и насос расщепляет АТФ. Он не может достичь этого состояния, если ион поступает из окружение клетки. Когда кальций выходит из этого состояния, наступает «точка невозврата». Это механизм, который объясняет, что помпа работает как помпа, а не просто как пассивный канал.
Это действительно уникальное открытие основано на продвинутых экспериментах. Эти эксперименты позволяют нам впервые увидеть, как насос выполняет свою работу», - объясняет постдок Матеуш Дыла, который является первым автором новой статьи и был главной движущей силой проекта, который начался как его работа. Кандидатская диссертация.
Кальцевому насосу нужна энергия, которую он получает от расщепления молекулы АТФ, как объяснялось ранее. Выделяемая энергия преобразуется в работу насоса. Это объясняет, как возникают большие градиенты концентрации между внутренней и внешней частью клетки. Разница в концентрации может быть более чем в 10 000 раз, и эта большая разница необходима для связи между клетками, например, для передачи нервных сигналов.
Дым и зеркала
Причина, по которой эксперименты настолько сложны, довольно ясна: насос настолько мал, что его невозможно увидеть непосредственно в световой микроскоп. До сих пор и с большим трудом исследователи создали молекулярные модели стабильных состояний насоса, используя технику, известную как рентгеновская кристаллография. Это аналог покадрового фильма. Ученые в шутку назвали свою визуализацию движения помп между этими состояниями «помповой фантастикой». Новое исследование, на подготовку которого ушло пять лет, переводит визуализацию с остановленного движения на живые изображения функциональных движений помпы. Техническое усовершенствование микроскопических методов позволило наблюдать новое состояние.
Используемый метод известен как флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул и использует явление, известное как резонансная передача энергии Фёрстера, сокращенно FRET. Здесь объединены интенсивный лазерный свет и сверхчувствительные камеры, чтобы обеспечить прямое наблюдение за отдельной молекулой через крошечное количество света, излучаемого каждой молекулой.
Исследовательская группа воспользовалась преимуществом кальциевого насоса из бактерии Listeria, которая была подготовлена для исследований с помощью белковой инженерии. На разработку одного только белка ушло несколько лет.
В экспериментах FRET две молекулы красителя присоединяются к белку, который затем освещается лазерным светом. Один краситель, донор, будет поглощать лазерный свет и либо излучать его с характерным цветом. В качестве альтернативы он может передавать энергию другому красителю, акцептору, который затем будет излучать свет другого цвета. Таким образом, свет будет излучаться двумя красителями, и ученые смогут измерить расстояние между двумя красителями, измеряя, сколько света излучается каждым цветом. Поскольку красители были аккуратно введены в два определенных места в насосе, эти изменения расстояния отслеживают движения насоса.
Техника одиночных молекул позволила сделать новые открытия, объясняет Магнус Кьергаард, научный сотрудник Орхусского института перспективных исследований, AIAS, который также внес свой вклад в открытие:
Мы перешли от 'Pump Fiction' к 'Pump Live'. Раньше мы всегда записывали сигналы от многих молекул одновременно, что размывало движения. Используя технику FRET с одной молекулой, мы можем сосредоточиться на одна молекула за раз, что позволяет нам напрямую наблюдать структурные изменения. Это дает нам видео насоса в действии с меньшим количеством промежутков. Наш фильм «Фантастика о насосе» изначально получил свое название, потому что мы знали переходы между различными состояниями. цикла были вымышленными, и что в промежутках между известными состояниями могут скрываться дополнительные идеи. Мы сейчас продемонстрировали это в изобилии и в то же время выявили новые важные идеи о том, как работает насос».
Помимо расширения наших знаний об основных процессах жизни, понимание этих насосов также может иметь практическое применение. Мутации в помпах могут вызвать дефекты в клетках головного мозга, что может привести к неврологическим расстройствам, таким как мигрень, временный паралич или нейродегенеративные расстройства.
Таким образом, механизмы этих ионных насосов имеют решающее значение для понимания ошибок в насосе, особенно с целью разработки новых лекарств, нацеленных на насос.
Мы еще не достигли того состояния, когда мы можем применить наши исследования ионных насосов для лечения болезней! Однако новые идеи привели к идеям, которые можно использовать для разработки лечения, например, дефектов нейронной сигнализации. … Но это работа на будущее. Прямо сейчас есть все основания праздновать раскрытие интимных подробностей одного из самых важных ферментов жизни. Работа основана на тесном сотрудничестве здесь, в университете, и с исследователями в США. Мы уже начали новое увлекательное сотрудничество, которое позволит нам сделать следующие шаги», - говорит профессор Пол Ниссен.