Принстонские исследователи впервые раскрыли механизм того, как бактерии создают слизистые массы, называемые биопленками, клетка за клеткой. Когда бактерии заключены в биопленки в организме человека, они в тысячу раз менее восприимчивы к антибиотикам, что делает некоторые инфекции, такие как пневмония, трудноизлечимыми и потенциально смертельными.
В исследовании, опубликованном 6 сентября в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences, инженеры и биологи Принстонского университета проследили за превращением одной бактериальной клетки в зрелую биопленку из 10 000 клеток с упорядоченной архитектурой. Полученные данные должны помочь ученым узнать больше о поведении бактерий и открыть новые способы воздействия на биопленки лекарствами.
«Никто никогда не заглядывал внутрь живой биопленки и не наблюдал, как она развивается клетка за клеткой», - говорит Бонни Басслер, старший автор статьи и профессор молекулярной биологии Сквибба в Принстоне, а также в Медицинском институте Говарда Хьюза. Следователь. «Благодаря этой статье мы впервые можем понять, как сообщества бактерий образуют биопленку».
Открытие стало возможным благодаря специальному методу микроскопии, впервые примененному в Принстоне бывшим научным сотрудником с докторской степенью Кнутом Дрешером, который позволил визуализировать отдельные клетки, позволяя исследователям следить за растущей биопленкой в режиме реального времени.
«Мы использовали современную технику, чтобы заглянуть в сердцевину живой, растущей биопленки», - сказал научный сотрудник с докторской степенью Цзин Ян, ведущий автор нового исследования. Помимо членства в лаборатории Басслера, Ян входит в группу Complex Fluids Group, возглавляемую старшим соавтором статьи Говардом Стоуном, профессором машиностроения и аэрокосмической техники Дональда Р. Диксона '69 и Элизабет Диксон в Принстоне. Яна также консультирует старший автор статьи Нед Уингрин, профессор Говарда А. Прайора наук о жизни и исполняющий обязанности директора Института интегративной геномики Льюиса-Сиглера в Принстоне.
«Исследование, в результате которого была подготовлена эта статья, находится на стыке материаловедения, инженерии, физики и биологии и представляет собой фантастическое сотрудничество в Принстонском университете», - сказал Басслер.
Наряду с Яном, Басслером, Стоуном и Уингрин пятым соавтором статьи является Эндрю Шаро, бывший студент физического факультета Принстона, а ныне работающий в Калифорнийском университете в Беркли.
Исследователи выбрали Vibrio cholerae в качестве модели биопленочного организма из-за его долгой истории изучения и угрозы для здоровья человека, вызывающей диарейное заболевание холера. Изогнутая палочковидная бактерия V. cholerae живет свободно плавающей клеткой в солоноватой или соленой воде. Когда V. cholerae вступает в контакт с частицей пищи, например, с панцирем краба или креветки, или с клеткой кишечника человека во время болезни, бактерия прикрепляется и начинает размножаться. Члены расширяющейся колонии выделяют клейкое вещество, чтобы не смыться водой и защитить себя от конкурирующих бактерий.
Предыдущие попытки выяснить, как взаимодействуют клетки в растущей биопленке, не увенчались успехом из-за недостаточного оптического разрешения; по сути, то, что делала одна клетка в непрозрачной массе, нельзя было отличить от соседей.
Исследователи из Принстона решили эту проблему несколькими способами. Во-первых, они генетически модифицировали бактериальный штамм, чтобы клетки производили белки, которые ярко светятся при освещении определенными цветами света. Отобранные белки обеспечивают самую яркую доступную флуоресценцию, облегчая обнаружение каждой клетки и снижая интенсивность потенциально повреждающего клетки света, необходимого для эксперимента.
Затем команда использовала конфокальный микроскоп, устройство, которое фокусируется на одной части образца с определенного расстояния. Сделав сотни таких наблюдений, изображения можно сложить вместе, чтобы создать трехмерное изображение всего образца. «Это все равно, что заглянуть внутрь биопленки, не разрезая ее», - сказал Ян.
Еще одним стимулом для исследовательской группы стали компьютерные алгоритмы, изначально разработанные для таких областей, как материаловедение. Алгоритмы дифференцировали тесно сгруппированные источники света, в данном случае множество сгруппированных клеток V. cholerae в утолщающейся биопленке.
То, что увидела команда из Принстона, было замечательным. Сначала в эксперименте колония бактерий разрасталась горизонтально на заданной поверхности. По мере деления каждой клетки образующиеся дочерние клетки прочно прикрепляются к поверхности вместе со своими родительскими клетками. Однако из-за растущего числа потомков бактерий клетки в центре расширяющейся колонии были вынуждены отделиться от поверхности и устремиться вертикально. Таким образом, бактериальная колония превратилась из плоской двумерной массы в расширяющийся трехмерный шарик, удерживаемый вместе мусором в развивающейся биопленке.
Принстонская команда немного глубже изучила генетику, лежащую в основе такого клеточного поведения. Единственный ген, получивший название RbmA, является ключом к поведению, при котором новые клетки соединяются таким образом, чтобы образовалась трехмерная биопленка. Когда исследователи деактивировали ген, образовалась большая, диффузная и гибкая биопленка. Однако, когда RbmA работал как обычно, образовывалась более плотная и прочная биопленка, поскольку клетки оставались связанными друг с другом. Таким образом, RbmA придает биопленке ее устойчивость, обеспечивая понимание потенциальной ахиллесовой пяты, на которую можно направить терапевтическое вмешательство.
В настоящее время ведется работа по измерению физических сил, испытываемых клетками, поднимающимися в центре биопленки, чтобы можно было точно определить общую механику. «В настоящее время мы пытаемся разработать математическую модель того, как бактериальная колония растет во времени и как пространственные особенности связаны с типичными механическими характеристиками биопленки», - сказал Стоун.
Исследователи также планируют применить свой новый метод микроскопии для изучения других бактерий, образующих биопленки, вызывающих болезни человека. Один пример: Pseudomonas aeruginosa, основная причина смертельных инфекций легких у людей с муковисцидозом. Еще одним возбудителем является золотистый стафилококк, обычно называемый стафилококком. Интересно, что механизм образования биопленок этими двумя бактериями должен отличаться от V. cholerae. Хотя клетки P. aeruginosa имеют палочковидную форму, как и V. cholerae, они имеют выступы, которые помогают им ползать по поверхности. Между тем клетки стафилококка имеют сферическую форму, поэтому они не могут быть соединены своими полюсами.
Методы, разработанные Яном и его коллегами, могут помочь исследователям-медикам узнать об эффективности лекарств с генетически различающимися членами одной и той же бактериальной биопленки и с биопленками различной архитектуры. Будущая работа может предложить способы лучшего разрушения защитной пленки, чтобы антибиотики могли полностью проникать и уничтожать болезнетворные микробы.