Исследователи Университета Райса разработали вычислительную модель для количественной оценки механизма, с помощью которого белки CRISPR-Cas9 находят свои цели для редактирования генома.
Анатолий Коломейский, профессор химии, химической и биомолекулярной инженерии Райса, и выпускник Алексей Швец адаптировали систему, которую они разработали ранее, чтобы показать, как белки обычно находят свои биологические цели. Они надеются, что пересмотренная модель поможет раскрыть оставшиеся загадки CRISPR.
В своем естественном состоянии CRISPR, что означает «группированные короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами», является биологическим механизмом, с помощью которого бактерии защищают себя от вирусных инфекций. Бактерии включают копию чужеродной ДНК и составляют список всех тех, кто вторгается. Они обращаются к этой записи при обнаружении новых захватчиков и используют ее для их уничтожения.
В последние годы исследователи начали адаптировать механизм для использования в редактировании генома, который потенциально может лечить болезни и улучшать организмы, включая людей. Но камнем преткновения был риск того, что белки CRISPR-Cas9, одна из систем, использующих подход CRISPR, будут вырезать и заменять неправильные последовательности-мишени, вызывая мутации..
Модель Райса, описанная в журнале Biophysical Journal, показала, что CRISPR-Cas9 более эффективно находит хорошие мишени, когда эти нецелевые правки могут происходить, потому что белки не тратят время на диссоциацию от нецелевых целей к продолжить поиск.
Это может быть хорошо, а может и нет, но это, безусловно, заслуживает изучения, сказал Коломейский.
"Коэффициент ошибок (нецелевое резание) иногда составляет 10-20 процентов", - сказал он. «У нас есть две идеи по этому поводу: во-первых, вирусы мутируют очень быстро, и, возможно, бактерии пытаются разрезать мишени, которые лишь слегка мутированы, чтобы быть более гибкими. Во-вторых, существуют белки, которые могут исправлять ошибки, поэтому, если не так много неправильных сокращений, система может их терпеть.
"Исходя из нашей модели, мы считаем, что обрезка вне цели действительно может ускорить резку по цели."
Коломейский сказал, что его модель - это простой шаг к выяснению динамики редактирования CRISPR. «CRISPR-Cas9 - самый популярный вариант, потому что он состоит только из одного белка и биологически с ним проще работать», - сказал он.
Лаборатория Райса разработала свою оригинальную модель, чтобы изучить, как белки скользят по ДНК, чтобы найти мишени и запустить такие процессы, как транскрипция генов. Коломейский отметил, что пионер CRISPR Дженнифер Дудна обнаружила, что CRISPR-Cas9 не ищет таким же образом. «Она обнаружила, что он нигде не скользит по ДНК», - сказал он.
Вместо этого, по словам Дудны и ее команды, белок изначально распознает последовательности PAM из трех нуклеотидов (для мотива, примыкающего к протоспейсеру), которые отмечают местоположение потенциальных мишеней. «CRISPR находит и связывается с PAM, а затем связанная с ним РНК исследует соседнюю ДНК, чтобы определить, является ли она целью», - сказал Коломейский. «Если это так, белок начинает сокращаться. Если нет, он диссоциирует и ищет что-то другое».
В последующих экспериментах Дудны с удаленными последовательностями PAM белки CRISPR-Cas9 вообще не могли найти свои мишени. Таким образом, PAM играют важную роль, а не просто универсальный разделитель, сказал он. «Как только я прочитал это, я понял, что мы можем использовать нашу модель и здесь».
Теоретическая модель рассматривает процессы первого прохождения - те, которые происходят, когда система пересекает физический или химический порог, например, находит соответствующий PAM - для отслеживания белков CRISPR-Cas9, вставленных в клетку, когда они впервые исследуют последовательности PAM. а затем, будучи связанными с PAM, ищите мишень ДНК, которая соответствует РНК Cas9.
Они обнаружили, что CRISPR, которые избегают нецелевых разрезов, отделяясь от «неправильной» ДНК, занимают больше времени, чем CRISPR, которые просто отсекают нецелевые объекты. «Переход к неправильному PAM требует времени», - сказал Коломейский. «Наши расчеты показывают, что CRISPR может быстрее находить реальные мишени, когда он иногда режет не в тех местах. Доля, которая идет к нужным мишеням, может быть меньше, но в конце концов вы их вырежете.
"Это простая модель и точно решаемая", - сказал Коломейский. «Если кто-то хочет проверить, модель может предоставить конкретные прогнозы и в некоторых случаях предложить тенденции того, что следует наблюдать». Чего не хватает в модели, так это возможности увидеть, распознает ли ключ РНК свою цель одновременно - связываясь с ДНК сразу - или последовательно, нуклеотид за нуклеотидом.
"Самое впечатляющее в CRISPR - это не открытие иммунной системы у бактерий, а тот факт, что это произвело революцию в биотехнологии, потому что это означает, что в любой клетке мы можем разрезать любую ДНК в определенном месте., очень точно", - сказал Коломейский.«Я надеюсь, что наша работа будет стимулировать более фундаментальные исследования, потому что мне очень нравится метод CRISPR. Но я не в восторге, когда люди применяют его, не понимая, как он работает на молекулярном уровне».
Швец сейчас является постдокторантом в Массачусетском технологическом институте. Коломейский - профессор химии, химической и биомолекулярной инженерии.
The Welch Foundation, Национальный научный фонд и Центр теоретической биологической физики Райс поддержали исследование.