Исследователи Центра инженерии генома при Институте фундаментальных наук (IBS, Южная Корея) определили уровень ошибок инструментов редактирования ДНК, основанных на CRISPR и известных как редакторы оснований аденина. Оценка полногеномной целевой специфичности этих инновационных методов имеет важное значение для использования их приложений в клиниках и биотехнологиях. Их выводы были опубликованы в журнале Nature Biotechnology..
Четыре буквы или основания ДНК представляют собой алфавит, используемый нашими клетками: пары аденинов (А) с тиминами (Т), цитозины (С) с гуанинами (G), образуя уникальную комбинацию из 3,2 миллиардов букв, что делает нас теми, кто мы есть. Поскольку некоторые генетические заболевания вызываются мутацией всего одной буквы, некоторые приложения CRISPR - очень успешного и мощного инструмента генной инженерии - связаны с исправлением этой разницы в одной букве. Примерами белков, которые можно добавить в систему CRISPR для ускорения преобразования букв, являются: редакторы оснований цитозина (CBE) для преобразования C в T и редакторы оснований аденина (ABE) для изменений A в G. Команда IBS была заинтересована в изучении специфики ABE, поскольку она до сих пор не была известна.
Команда под руководством Джин-Су Кима изучила частоту ошибок недавно разработанных белков ABE, ABE7.10, в клетках человека. Они точно определили позиции в геноме человека, затронутые ABE7.10 и просканирован на наличие ошибок за пределами цели. Для этого они использовали адаптированную версию Digenome-seq, метод секвенирования, разработанный тем же исследовательским центром, который уже успешно определил точность CBE, CRISPR/Cas9 и CRISPR/Cpf1, среди прочих. Они протестировали ABE7.10 с семью направляющими РНК, соответствующими семи буквам-мишеням ДНК, а также сравнили результаты с обычным CBE и нуклеазой Cas9. Модифицированный Digenome-seq может обнаружить в среднем 60 нецелевых ошибок во всем геноме человека. И что интересно, хотя эти три белка были сконструированы для нацеливания на один и тот же сайт, они распознавали разные нецелевые точки.
Биологи СРК также продемонстрировали некоторые стратегии, позволяющие ограничить количество нецелевых модификаций. Добавление пары G в конце направляющей РНК уменьшило количество нецелевых ошибок, а также использование другого типа Cas9 (Sniper-Cas9, разработанный той же командой в 2018 г.) и доставку ABE7.10. через предварительно собранные рибонуклеопротеины, а не через плазмиды.
Команда стремится внести свой вклад в разработку ABE, чтобы внести желаемые однобуквенные изменения более точным и эффективным способом. «Поскольку точность базового редактора доказана, мы ожидаем, что в будущем он найдет широкое применение в медицине и сельском хозяйстве», - говорит Джин-Су Ким.