Команда Университета Алабамы в Бирмингеме под руководством Джамиля Саада, доктора философии, определила последнюю неизвестную структуру белка ВИЧ-1, ретровируса, который может вызывать СПИД.
Знание этой структуры, называемой цитоплазматическим хвостом белка gp41, поможет исследователям лучше понять, как вирус заражает клетки человека и как вирусы-потомки собираются и высвобождаются из инфицированных клеток. Цитоплазматический хвост, по-видимому, играет ключевую роль в сборке вируса, помогая включать шиповидные структуры оболочки в поверхность вирусных частиц.
«Если мы способны ингибировать включение белка оболочки, мы ингибируем репликацию вируса», - сказал Саад. «Это обезоружит вирус и предотвратит заболевание. Цитоплазматический хвост является критическим компонентом инфекционности».
Структура цитоплазматического хвоста gp41 была чрезвычайно сложной задачей, говорит Саад, адъюнкт-профессор микробиологии UAB.
"Это был самый сложный проект, с которым мне приходилось сталкиваться за последние 20 лет. Много раз я собирался уйти, но у меня очень настойчивая лабораторная группа."
Саад знает о многих других исследовательских группах, которые не смогли определить молекулярную структуру.
Одной из проблем для Саада и его коллег из UAB стала попытка экспрессии цитоплазматического хвоста gp41 в растущих клетках E. coli. Вместо интактного продукта бактериальный фермент разрезал белок во время экспрессии белка. «Мы никогда не видели этого для любого другого белка», - сказал Саад. Исследователи обнаружили, что им пришлось ограничить экспрессию белка всего двумя часами. Даже тогда 70 процентов цитоплазматического хвоста было отрезано, и только 30 процентов остались нетронутыми.
Потребовалось более двух лет и усилий с сотней различных условий, чтобы получить хороший продукт, говорит Саад. "Теперь мы можем сделать это за два дня."
Нарезка оказалась полезной. Одна часть оказалась растворимой, и группа Саада смогла изучить ее структуру с помощью ядерного магнитного резонанса или ЯМР. Другая часть была нерастворимой, поэтому исследователям пришлось использовать раствор мицелл - диспергированных липидов или детергентных агрегатов в растворе - чтобы позволить нерастворимой части сформировать свою структуру в мембраноподобной среде. Как и условия роста, исследователям потребовалось много испытаний, чтобы найти подходящие условия мембраны. Раствор мицеллы чем-то похож на уксус и масло после сильного встряхивания, чтобы распределить крошечные капельки масла по заправке.
Опять же, ЯМР был использован для определения нерастворимой структуры при включении в мицеллы.
Когда группа Саада поместила молекулы неповрежденного полноразмерного цитоплазматического хвоста gp41 в раствор мицеллы, они обнаружили, что структура каждой из частей сохранилась в неповрежденной структуре.
Они обнаружили, что N-концевой конец цитоплазматического хвоста gp41, состоящий из 45 аминокислотных остатков, не имеет регулярной вторичной структуры и не связан с мембраной, которая обертывает вирусную частицу ВИЧ-1, подобно кожаный чехол бейсбольного мяча. С-концевой конец цитоплазматического хвоста gp41, состоящий из 105 аминокислотных остатков, был тесно связан с мембраной и имел три альфа-спирали с гидрофобными и гидрофильными участками. Группа UAB также показала предпочтительную топологию цитоплазматического хвоста, связанного с мембраной.
Саад говорит, что структура открывает совершенно новые области исследований: как цитоплазматический хвост стабилизирует структуру белка оболочки, как он влияет на подвижность мембраны структуры белка оболочки и как он помогает координировать связывание мембраны и ассоциацию 2000 полипротеинов Gag ВИЧ-1 под поверхностью мембраны. Полипротеины Gag позже разрезаются внутри созревающего вируса с образованием множества меньших белков матрикса, капсида и нуклеокапсида, которые образуют конденсированное ядро вируса.
Саад говорит, что знание структуры цитоплазматического хвоста gp41 также позволит провести сравнительные исследования 10 различных ретровирусов с похожими хвостами, чтобы выяснить, почему у одних хвосты короче, а у других длиннее.
«Цитоплазматический хвост gp41 вызывает интерес в течение длительного времени, и никто не понимает, как он функционирует при инфекции или как он помогает включать оболочечный белок в мембрану», - сказал Саад.