Для размножения вирусов им обычно нужна поддержка клеток, которые они заражают. Во многих случаях только в ядре своего хозяина они могут найти машины, ферменты и строительные блоки, с помощью которых они могут размножить свой генетический материал, прежде чем заразить другие клетки. Но не все вирусы попадают в ядро клетки. Некоторые остаются в цитоплазме и, следовательно, должны иметь возможность независимо размножать свой генетический материал. Для этого им приходится привозить собственный «машинный парк». Существенную роль в этом процессе играет особый фермент, состоящий из различных субъединиц - РНК-полимераза. Этот комплекс считывает генетическую информацию из генома вируса и транскрибирует ее в информационную РНК (мРНК), которая служит чертежом для белков, закодированных в геноме.
Ученым из Биоцентра Вюрцбургского университета Юлиуса-Максимилиана (JMU) и Института биофизической химии им. Макса Планка (MPI) в Геттингене впервые удалось решить трехмерную структуру осповакцины вирусная РНК-полимераза с атомарным разрешением. Вирус коровьей оспы принадлежит к семейству поксвирусов, безвреден для человека и составляет основу всех противооспенных вакцин. Благодаря своим щадящим свойствам он в настоящее время тестируется для онколитической виротерапии, новой стратегии борьбы с раком.
Ответственными за эту работу являются Утц Фишер, заведующий кафедрой биохимии I Университета JMU в Вюрцбурге, и Патрик Крамер, директор и заведующий кафедрой молекулярной биологии MPI биофизической химии. В двух одновременных публикациях в журнале Cell они теперь представляют результаты своего сотрудничества.
Молекулярный зажим, который держит все вместе
«РНК-полимераза вируса коровьей оспы существует в основном в двух формах: основной фермент и еще более крупный комплекс, который благодаря различным дополнительным субъединицам обладает особыми функциями», - объясняет Фишер. Основной фермент во многом подобен другому известному ферменту, который долгое время был в центре внимания отдела Крамера: клеточной РНК-полимеразе II. Он находится в ядре клетки, где он считывает информацию о геноме и транскрибирует ее в мРНК. Фишер называет второй комплекс РНК-полимеразы коровьей оспы «универсальным». Состоящая из многочисленных субъединиц, она осуществляет весь процесс транскрипции вируса, тем самым обеспечивая важный этап в размножении патогена.
Комплекс удерживается вместе молекулой, которую вирус одалживает из своей клетки-хозяина: так называемой транспортной РНК (тРНК). Этот тип молекулы обычно не играет роли в транскрипции, но обеспечивает строительные блоки аминокислот для производства белка. «Без участия тРНК-хозяина этот огромный механизм со всеми его специфическими субъединицами развалился бы», - говорит структурный биолог Клеменс Гримм, который провел структурный анализ вместе с Хауке Хилленом из MPI. Исследователи подозревают, что молекула тРНК, помимо своей соединительной функции, выполняет еще одну важную задачу. «Эта тРНК может быть загружена только глютамином, аминокислотой, необходимой не только для производства белков, но и важным источником энергии и азота для клетки», - объясняет Аладар Салай, соавтор исследования и директор Ракового центра. Центр терапевтических исследований (CTRC) при JMU. Поскольку репликация вируса зависит от азота, тРНК может служить сенсором, который предоставляет вирусу информацию о текущем содержании азота в клетке-хозяине. Если уровень азота падает ниже определенного значения, это может быть сигналом для того, чтобы вирус как можно скорее покинул своего хозяина. Но это пока только гипотеза.
Чтобы выяснить, как работает вирусная РНК-полимераза, исследователи также определили ее трехмерную структуру на разных этапах транскрипции. Благодаря этим новым открытиям теперь можно понять весь процесс размножения вируса на структурной основе. Как в кино, можно проследить, как работает эта молекулярная машина на атомарном уровне и как хореографируются отдельные процессы. «Что удивительно, так это то, как строительные блоки машины перестраиваются после начала транскрипции, чтобы управлять синтезом продукта РНК - этот комплекс действительно очень динамичен», - объясняет Хиллен. Чтобы получить это представление, биохимикам и структурным биологам пришлось тесно сотрудничать: биохимики Джулия Бартули и Кристина Беденк из JMU очистили и биохимически охарактеризовали полимеразный комплекс со всеми его взаимодействующими компонентами в течение года. Структурные биологи Гримм и Хиллен тогда отвечали за определение трехмерных структур.
Супермикроскоп предоставляет необходимые данные
Исследователи получили данные с устройства, которое произвело революцию в структурном анализе в последние годы: криоэлектронные микроскопы последнего поколения, которые работают как в JMU, так и в MPI. При напряжении 300 000 вольт он пропускает электроны через образцы, охлажденные до минус 180 градусов по Цельсию, и таким образом создает изображения с разрешением порядка атомов. Микроскоп позволяет изучать биологические молекулы и комплексы, реконструировать их трехмерную структуру.
В течение примерно шести месяцев Гримму и Хиллену пришлось работать со своими компьютерами, пока они не разработали пространственную модель полимеразных комплексов из нескольких терабайт данных. «Без новых криомикроскопов в наших учреждениях и отличного сотрудничества между двумя группами это было бы невозможно так быстро и с таким качеством», - говорит Гримм. С помощью 3D-очков каждый теперь может пространственно визуализировать комплекс, произвольно поворачивать его и разбирать на составные части.
Среди прочего, новые результаты позволяют разрабатывать ингибиторы и модуляторы, влияющие на цикл размножения вируса. Поскольку репликация коровьей оспы происходит в цитоплазме, ученые также ожидают, что она обладает терапевтическим потенциалом. В настоящее время во всем мире ведутся исследования, в которых вирусы коровьей оспы используются в борьбе с раком. Компания Genelux, также участвовавшая в исследовании, уже продемонстрировала в экспериментах на животных и пациентах потенциал специально оптимизированных вирусов коровьей оспы для уменьшения размеров опухолей и выявления мельчайших метастазов. Кроме того, исследователи ожидают новых и захватывающих открытий в отношении функционирования родственных невирусных РНК-полимеразных комплексов.