Основным препятствием для редактирования генома в клетке является, ну, сама клетка.
«Человеческие клетки не любят впитывать вещества», - объяснил Норберт Райх из Калифорнийского университета в Санта-Барбаре, профессор кафедры химии и биохимии. Он объяснил, что клетка человека развила механизм «утилизации мусора», который изолирует и расщепляет чужеродные белки и другие нежелательные биомолекулы, патогены и даже поврежденные клеточные структуры. Таким образом, для людей, работающих в таких областях, как биотехнология, биофармакология, геномные исследования и терапия, например, для тех, кто работает с мощной технологией редактирования генов CRISPR-Cas9, результаты будут настолько хороши, насколько хороша их способность эффективно обходить этот защитный механизм и точно вводить белки в клетки. клетки животных.
Райх и его команда разработали такой метод. Их метод, по оценкам, в 100-1000 раз более эффективен, чем современные методы, дает пользователям полный пространственно-временной контроль над доставкой редактирования генома, фактически позволяя им точно решать, когда и где выпустить белки для редактирования генома.
«Мы действительно можем поражать отдельные клетки», - сказал Райх. «Мы можем даже поражать части клетки, чтобы высвобождать белок только в часть клетки. Но главное, что у нас есть контроль над тем, где и когда этот белок, который собирается разрезать ДНК, будет высвобожден».."
Исследование группы Райха «Редактирование генома, запускаемое светом: редактирование генов, опосредованное рекомбиназой Cre, с помощью ближнего инфракрасного света» опубликовано в журнале Small.
Одним из недавних прорывов в биотехнологии, привлекающих внимание, является использование белков для редактирования генов - «молекулярных ножниц», таких как CRISPR, Cas и, в данном исследовании, Cre - для поиска, вырезания и вставки определенных участков последовательностей ДНК-мишеней.. Первоначально защитный механизм, используемый бактериями и археями для распознавания ДНК атакующих вирусов и маркировки их для уничтожения, с тех пор ученые разработали методы распознавания, разрезания и связывания последовательностей пар оснований различной длины с использованием различных белков. Потенциал этой технологии огромен и варьируется от фундаментальных исследований, определяющих функции и идентификацию генов, до методов лечения, которые могут исправить дефекты на клеточном уровне.
Ключом к редактированию генома, запускаемому группой Райха, являются полые золотые наносферы, на которые нанесены репортерные нити ДНК (они флуоресцируют красным) и белковый сплав рекомбиназы Cre и проникающих в клетку пептидов. И ближний инфракрасный свет.
«Итак, теперь у нас есть самонаводящееся устройство и агент доставки», - сказал Райх, пояснив, что рекомбиназа Cre и слияние пептидов действуют как система наведения, которая вступает в игру, когда клетка-мишень выполняет свою клеточную функцию. вывоз мусора.
Попав в клетку, нанооболочка покрывается эндосомой - мембранным карманом, который изолирует ее и транспортирует через клетку.
«Но нанооболочки ничего не делают, потому что они в ловушке», - сказал Райх. Сверхбыстрый импульсный лазерный свет ближнего инфракрасного диапазона, который безвреден для клеток и эффективно проникает в ткани, затем направляется на захваченные нанооболочки и их белковые оболочки.
«Для длин волн ближнего инфракрасного диапазона происходят действительно интересные вещи», - сказал Райх. «Это заставляет золотую нанооболочку возбуждаться, и это приводит к тому, что все, что мы прикрепили, отрывается». В то же время формируются нанопузырьки, открывающие эндосомы и позволяющие вытекать ее белковому содержимому. Теперь белки могут свободно проникать в ядро клетки, где хранится ее генетический материал, и проникать внутрь с проникающим в клетку пептидом. И Cre может приступить к работе по поиску, вырезанию и вставке репортерских нитей в спираль.
Эксперимент группы in vitro оказался успешным: после периода инкубации клетки, пронизанные покрытыми белком нанооболочками, с последующим облучением светились красным.
«Мы не разработали ничего, что заставило бы клетки вести себя по-другому», - сказал Райх. «Мы сделали так, чтобы клетка выглядела по-другому из-за этого флуоресцентного белка».
Сказал ведущий автор статьи, Дин Моралес, который в настоящее время является постдокторантом в Лос-Аламосской национальной лаборатории: «В качестве базового исследовательского инструмента с пространственно-временным контролем каждая клетка может стать экспериментом. Представьте, что вы хотели бы изучить функция определенного гена и то, как он изменяет поведение этой клетки или ее поведение с ближайшим соседом. Используя плазмонные наночастицы в качестве антенны, мы можем либо включать, либо выключать интересующий ген и наблюдать в реальном времени разветвления его деятельность."
Пространственно-временной контроль также позволяет тем, кто его применяет, легко воздействовать на ДНК, переписывание которой, как признают исследователи, имеет очень мощный и трансгенерационный эффект.
«В некоторых случаях, таких как соматические мутации, не каждая клетка в организме требует редактирования», - сказал Моралес. «Возможность контролировать, где и когда может использоваться механизм редактирования, обеспечивает быстротечность процедуры. Важность этого заключается в том, что современные подходы к редактированию генов часто приводят к тому, что механизм редактирования остается в активной форме в целевой клетке с неизвестным долгосрочные последствия. Наш подход предоставляет механизм редактирования временным образом и, таким образом, позволяет обойти эту проблему».
Исследование по этому проекту также проводили соавторы Эрин Морган, Меган МакАдамс и Аманда Б. Хрон из Калифорнийского университета в Санта-Барбаре; и Чон Ын Шин и Джозеф Засадзински из Университета Миннесоты.