После 13 быстрых делений оплодотворенное яйцо мухи состоит примерно из 6000 клеток. Они все одинаковые под микроскопом. Однако к тому времени каждая клетка эмбриона Drosophila melanogaster уже знает, суждено ли ей стать нейроном или мышечной клеткой, частью кишечника, головой или хвостом. Теперь команды Николауса Раевского и Роберта Цинцена из Берлинского института биологии медицинских систем (BIMSB) Центра молекулярной медицины Макса Дельбрюка в Ассоциации Гельмгольца (MDC) проанализировали уникальные профили экспрессии генов тысяч отдельных клеток и повторно собрали эмбрион. из этих данных с использованием нового алгоритма пространственного картирования. В результате получается виртуальный эмбрион мухи, показывающий, какие гены и где именно активны в данный момент времени. «По сути, это транскриптомный план раннего развития», - говорит Роберт Зинзен, глава лаборатории системной биологии дифференциации нервной ткани. Их статья появляется как первый выпуск в онлайн-выпуске журнала Science.
«Только недавно стало возможным анализировать полногеномную экспрессию генов отдельных клеток в больших масштабах. Николаус очень рано осознал потенциал этой технологии и применил ее в своей лаборатории», - говорит Зинцен. «Он начал задаваться вопросом, можно ли - учитывая сложную организованную ткань - вычислить полногеномные пространственные паттерны экспрессии генов только на основе данных транскриптома одной клетки». BIMSB объединяет лаборатории с разным опытом и опытом, подчеркивая необходимость использования вычислительной мощности для решения биологических задач. Оказывается, у института была не только идеальная модельная система - эмбрион дрозофилы - для ответа на вопрос Раевского, но и нужные люди с нужным опытом, от физики и математики до биохимии и биологии развития.
«Виртуальный эмбрион - это гораздо больше, чем просто упражнение по картированию клеток», - говорит Николаус Раевски, руководитель лаборатории системной биологии в лаборатории элементов, регулирующих гены, который с удовольствием вернулся к развитию мух через 15 лет после изучения элементов, регулирующих гены у дрозофилы. эмбрионов во время его постдокторской работы в Рокфеллеровском университете. Используя интерактивную базу данных Drosophila Virtual Expression eXplorer (DVEX), исследователи теперь могут посмотреть на любой из примерно 8000 экспрессированных генов в каждой клетке и спросить: «Ген X, где вы экспрессируетесь и на каком уровне? Какие другие гены активны на в то же время и в тех же камерах?» Он также работает с загадочными длинными некодирующими РНК. «Вместо трудоемких экспериментов с визуализацией ученые могут проводить виртуальные эксперименты, чтобы выявить новых регуляторных игроков и даже получить идеи для биологических механизмов», - говорит Раевски. «То, на что обычно уходят годы при использовании стандартных подходов, теперь можно сделать за пару часов».
Нарушение синхронности первых клеточных делений
В своей статье исследователи MDC описывают дюжину новых факторов транскрипции и множество других длинных некодирующих РНК, которые никогда ранее не изучались. Кроме того, они предлагают ответ на вопрос, который ставил ученых в тупик на протяжении 35 лет: как эмбрион нарушает синхронность клеточных делений для развития более сложных структур?
В процессе, называемом гаструляцией, формируются отдельные зародышевые листки, и клетки становятся ограниченными в отношении того, в какие ткани и органы они могут дифференцироваться. «Мы считаем, что сигнальный путь Бегемота, по крайней мере, частично отвечает за создание гаструляции», - говорит Раевски. Этот путь контролирует размер органов, клеточные циклы и пролиферацию клеток, но никогда не был вовлечен в развитие раннего эмбриона. «Мы не только показали, что Бегемот активен у мух, но даже смогли предсказать, в каких областях эмбриона это приведет к другому началу митоза и, следовательно, нарушит синхронность. И это только один пример того, насколько полезен наш инструмент для понимания механизмов, ускользнувших от традиционной науки».
Проект пережил тяжелый период созревания
Когда исследователи приступили к созданию виртуального эмбриона, они не знали, будет ли это возможно. Ключевым элементом их окончательного успеха является технология Drop-Seq, микрофлюидный метод на основе капель, который позволяет проводить транскрипционное профилирование тысяч отдельных клеток по низкой цене. Этот метод был недавно создан в лаборатории Раевского Джонатаном Аллесом, студентом летнего периода.
Однако эмбрионы мух нужно было отбирать именно в начале гаструляции. Филипп Вале, аспирант лаборатории Роберта Зинзена, вручную отобрал около 5000 из них, прежде чем разделить их на отдельные клетки. «Я был убежден, что это даст нам большой и совершенно уникальный набор данных. Это было для меня отличной мотивацией», - говорит Вале. Этот трудоемкий процесс создал новую проблему.«Вам нужно собрать данные за несколько сеансов, чтобы получить достаточно материала для запуска секвенирования», - говорит Кристин Кокс, возглавлявшая группу секвенирования отдельных клеток. В его состав вошли Джонатан Аллес, Салах Аюб и Анастасия Болтенгаген, которые совместно с ученым-компьютерщиком Никосом Караискосом оптимизировали секвенирование на основе капель. «Поэтому нам пришлось найти способ стабилизировать транскриптомы в клетках», - добавил Кокс. «Наконец, основываясь на своей более ранней работе с эмбрионами C. elegans, Николаус предложил использовать метанол». Новый метод фиксации одиночных клеток был опубликован в журнале BMC Biology в мае 2017 года.
По мере того, как данные становились все лучше и лучше, Никос Караискос, физик-теоретик и специалист по вычислениям в лаборатории Раевского, взялся за пространственное сопоставление такого большого количества клеток с их точным эмбриональным положением. Ни один из существующих подходов в области пространственной транскриптомики не подходил для реконструкции эмбриона дрозофилы. «Это был повторяющийся процесс фильтрации данных, просмотра того, что внутри, и попытки нанести это на карту. За это время она менялась много раз», - говорит Караискос. Между членами компьютерной лаборатории и лаборатории было много обменов мнениями, которые являются определяющей характеристикой BIMSB. «Мне приходилось все время подвергать сомнению свою работу., посмотрите, чего не хватает, и разработайте что-нибудь получше». Он придумал новый алгоритм под названием DistMap, который может сопоставлять транскриптомные данные клеток с их исходным положением в виртуальном эмбрионе.
Путешествие по неизведанным территориям
Создание виртуального эмбриона позволило Караискосу легко предсказать экспрессию тысяч генов, что было почти невыполнимой задачей с помощью традиционных экспериментальных средств. Филипп Вале при поддержке Клаудии Кипар подтвердил эти предсказания, визуализировав профили экспрессии генов на лабораторном столе с помощью традиционного подхода: гибридизация in situ позволяет визуализировать паттерны экспрессии генов с помощью цветных красителей, видимых под микроскопом. «На этом этапе весь эмбрион мухи окружен одним слоем клеток», - говорит Вале.«Это делает его очень доступным, что позволяет вам сравнивать вычислительные данные с изображениями».
Впервые стало возможным рассмотреть около 6 000 клеток эмбриона по отдельности, оценить профили экспрессии их генов и понять, что определяет их поведение в эмбрионе. «Самое важное технологическое достижение этого исследования заключается в том, что мы не теряем пространственную информацию, необходимую для понимания того, как эмбриональные клетки действуют согласованно», - говорят ученые. «Это действительно неизведанная территория, и для осмысления собранных данных требуются новые подходы к биоинформатике. Это прекрасно сработало в нашем сотрудничестве, не в последнюю очередь из-за уникального состава лаборатории Раевского, которая объединяет мокрую лабораторию и вычислительные подходы». Одним из основных преимуществ является то, что обе группы интересуются не только технологиями, но и интересуются конкретными биологическими вопросами, которые мотивируют их, говорит Раевски. «У Роберта есть глубокое понимание раннего развития. Мы можем проводить секвенирование отдельных клеток и располагать вычислительной мощностью для разработки инструментов, которые помогут нам на самом деле понять лежащие в основе регуляторные взаимодействия генов».
Группы уже планируют последующие проекты. Одним из примеров может быть картирование клеток в разные моменты времени, чтобы увидеть, как они работают вместе, образуя органы и ткани. Другой вариант - проверить, применимы ли методы картирования к более сложным тканям.