Фрагмент одиночной нити ДНК, построенной из азотистых оснований цитозина и гуанина, может быть запечатлен в полимере - это показали химики из Варшавы, Дентона и Милана. Полученный искусственный негатив рекордно большой длины химически функционирует как обычная цепь дезоксирибонуклеиновой кислоты. Это достижение окончательно подтверждает возможность создания полимерных импринтов ДНК, функционально соответствующих фрагментам ДНК, содержащим все четыре азотистых основания.
Полтора года назад польско-американо-итальянская группа исследователей создала химический ДНК-негатив с помощью молекулярного импринтинга. Молекулярные полости, созданные в тщательно разработанном полимере, химически вели себя точно так же, как реальная нить ДНК (дополнительная к той, которая использовалась для импринтинга). Первый олигомер, «впечатанный» в полимер, был коротким, состоящим всего из шести адениновых и тиминовых азотистых оснований, образующих последовательность ТАТААА. В настоящее время группа из Института физической химии Польской академии наук (IPC PAS) в Варшаве, возглавляемая профессором Влодзимежем Кутнером и сотрудничающая с Университетом Северного Техаса в Дентоне (США) и Миланским университетом (Италия), сделал следующий шаг. В журнале ACS Applied Materials & Interfaces исследователи представили процесс конструирования отрицательного фрагмента одиночной цепи ДНК, содержащего другие азотистые основания: цитозин и гуанин..
Олигонуклеотид, отпечатанный сейчас в полимере, немного длиннее, чем описанный в нашей предыдущей публикации. Однако речь шла не о том, чтобы побить рекорды. Самое главное, это должно было показать, что метод молекулярного импринтинга можно использовать для построения стабильные негативы олигонуклеотидов, содержащих все азотистые основания дезоксирибонуклеиновой кислоты», - говорит проф. Катнер.
Каждая молекула ДНК представляет собой скрученную в спираль ленту, состоящую из двух длинных, постоянно соединенных нитей. Одна цепь состоит из нуклеотидов с множественными повторами, каждый из которых содержит одно из азотистых оснований: аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) или тимин (Т). Поскольку аденин, присутствующий на одной цепи, комплементарен тимину на другой, а гуанин - цитозину, на основе одной цепи ДНК легко реконструировать ее комплементарного партнера. Этот механизм не только увеличивает постоянство записи генетического кода, но и позволяет транскрибировать его с ДНК на РНК в процессе транскрипции, что является первой стадией синтеза белка..
Молекулы ДНК очень длинные; если их распрямить, они будут иметь длину, измеренную в сантиметрах. Однако в нормальных условиях двухцепочечная ДНК скручена и свернута различными способами. импринтинг такой пространственно сложной структуры в полимере не только невозможен, но и не имеет смысла, поскольку разные молекулы одной и той же ДНК могут быть закручены по-разному. Поэтому, как правило, при тестировании двухцепочечной ДНК ее цепи сначала разделяют, а затем разрезают на фрагменты, содержащие от нескольких до нескольких десятков нуклеотидов. Затем можно попытаться запечатлеть эти фрагменты такой длины в полимере», - объясняет д-р Агнешка Петржик-Ле (IPC PAS).
Чтобы запечатлеть молекулы в полимере, их вводят в раствор мономеров, или «кирпичиков», из которых в дальнейшем должен быть сформирован будущий полимер. Некоторые из мономеров выбираются таким образом, чтобы самостоятельно собираться вокруг импринтируемых молекул. Затем смесь подвергают электрохимической полимеризации. В результате этой электрополимеризации образуется тонкая затвердевшая пленка полимера, из которой затем извлекаются отпечатанные молекулы. Таким образом получается полимер с молекулярными полостями, соответствующими исходным молекулам не только по размеру и форме, но даже по их локальным химическим свойствам.
В наших последних исследованиях мы показали, что можно впечатать в полимер олигонуклеотид GCGGCGGC, т.е.е. тот, который содержит восемь азотистых оснований. Этот олигомер является генетически значимым. Его наличие, среди прочего, увеличивает вероятность нейродегенеративных заболеваний», - объясняет аспирантка Катажина Бартольд (ИПЦ ПАН).
Первый полимерный негатив, с импринтированным аденин-тиминовым олигомером, был полностью селективным, то есть в молекулярные полости могли проникать только молекулы ТАТААА, ранее использованные для получения полимера. В синтезируемом в настоящее время полимере гуанин-цитозиновые полости также обладают высокой селективностью, однако эта селективность все еще оставляет желать лучшего. Если захваченный из раствора олигонуклеотид отличается только одним основанием от олигонуклеотида GCGGCGGC, использованного для импринтинга, полость может не заметить этой разницы. Исследователи связывают такое поведение с более сильными связями между гуанином и цитозином, чем между аденином и тимином.
Интересно, что в некоторых отношениях наш отрицательный ДНК обладает лучшими свойствами, чем свойства естественной цепи ДНК. Настоящая цепь ДНК имеет ядра нуклеотидов, электрически отрицательно заряженные, что заставляет молекулы отталкиваться друг от друга в растворе. Поэтому химики должны нейтрализовать этот заряд, например, вводя положительные ионы натрия. Наши молекулярные полости уже электрически нейтральны. Поэтому, используя наш полимерный аналог ДНК, мы исключаем один этап исследования: нейтрализацию», - отмечает д-р Петшик-Ле.
В ближайшем будущем исследователи намерены усовершенствовать разработанную методику, импринтируя все более длинные фрагменты ДНК, чтобы можно было картировать олигонуклеотиды, состоящие как минимум из дюжины или около того нуклеотидов. Полимерные пленки с такими длинными молекулярными полостями позволили бы создавать эффективные детекторы генетически важных фрагментов ДНК. Это стало бы возможным, так как масса полимера с полостями, заполненными олигомерами, захваченными из исследуемого раствора, увеличивается, электропроводность полимера также изменяется, и изменения этих параметров легко обнаруживаются. В будущем возможно и другое применение. Полимерные пленки с импринтированными фрагментами ДНК и молекулярными полостями, заполненными этими фрагментами, можно будет использовать для изучения новых лекарств, направленных на генетические заболевания.