Опечатка в черновике романа не является большой бедой. Однако природа часто менее прощает ошибки. Изменение всего одной буквы генетического кода может иметь катастрофические последствия для здоровья человека.
Такие геномные оплошности, связанные с одним основанием в ДНК или РНК, известны как точечные мутации. Они могут привести к легким отклонениям, таким как дальтонизм, а также к серьезным заболеваниям, включая нейрофиброматоз, серповидно-клеточную анемию, некоторые формы рака и болезнь Тея-Сакса. Мутации также могут вызывать варианты заболевания, устойчивые к обычному лечению.
Исследователи хотели бы обнаружить эти точечные мутации, чтобы лучше оценить уязвимые места в здоровье человека, обеспечить точную раннюю диагностику и назначить соответствующую терапию. Однако до сих пор регистрация тонких изменений, таких как точечные мутации, происходящие в живых клетках, была сложной задачей.
В новом исследовании ведущий автор Алекс Грин, научный сотрудник Центра молекулярного дизайна и биомиметики Biodesign, и его коллеги описывают новый метод обнаружения точечных мутаций. Этот метод можно применять в живых клетках, предлагая быстрые, высокоточные и недорогие средства идентификации мутаций, имеющих значение для здоровья человека.
Метод можно использовать в сочетании с бумажными диагностическими тестами (разработанными Грином и его коллегами), способными точно определять мутации и отображать цветовые показания в реакциях, вызванных теплом человеческого тела.
«Что мы сделали с нашей технологией, так это разработали новый портативный способ обнаружения мельчайших различий в последовательностях между РНК, которые вы пытаетесь обнаружить», - говорит Грин.«С помощью этих систем, которые мы называем SNIPR (для однонуклеотидных программируемых риборегуляторов), у нас есть возможность идентифицировать любую последовательность РНК на основе различия в одном нуклеотиде».
Этот метод настолько чувствителен, что может обнаруживать даже эпигенетические изменения - тонкие химические модификации генетических последовательностей, которые могут регулировать экспрессию генов без изменения идентичности отдельных оснований.
«Достижения в методе однажды могут быть использованы в качестве недорогой альтернативы персональному генотипированию», - считает Хао Ян, соавтор нового исследования и директор Центра молекулярного дизайна и биомиметики Biodesign. «Простота метода может позволить дома проводить скрининг на мутации, связанные с заболеванием, обеспечивая быстрое и точное тестирование, сохраняя при этом конфиденциальность данных для пользователей».
В дополнение к удобству недорогого универсального лакмусового теста для заболеваний, связанных с мутациями, метод обещает пролить новый свет на фундаментальные вопросы клеточной биологии, включая генетическую устойчивость к антибиотикам и мутации, приводящие к провалу передовых лечения таких заболеваний, как малярия и ВИЧ.
Азбука жизни
У человека генетический код состоит примерно из 3 миллиардов пар нуклеотидов, образующих знаменитую двойную спираль ДНК. Язык нуклеотидов, описывающий полный план построения любого живого организма, включая человека, состоит из последовательностей всего четырех букв: A, T, C и G, обозначающих четыре основания ДНК.
Последовательности этих четырех нуклеотидов образуют гены, которые обеспечивают инструкции по созданию белков. Белки обеспечивают структуру клеток и тканей; включая мышцы, хрящи, связки, волосы и кожу. Белки также обеспечивают жизненно важные механизмы жизни, контролируя бесчисленные клеточные процессы, включая метаболизм, передачу сигналов, иммунную защиту, пищеварение и деление клеток.
Охотничьи мутации
Точечная мутация в гене ДНК будет транскрибироваться в РНК, иногда выводя из строя полученный белок или изменяя его функцию, часто с последствиями для здоровья человека. Чтобы идентифицировать эти мутации, исследователи разработали SNIPR - умные структуры, содержащие комплементарные фрагменты РНК, способные связываться с последовательностями РНК в клетках.
Внутри клетки эти структуры активируются, когда они сталкиваются с мутировавшей последовательностью РНК, продиктованной модифицированным геном клетки.
Если связывание клеточной мутантной РНК с триггерной цепью является точным, SNIPR разворачивается, открывая доступ к последовательности рибосоме - механизму, необходимому для трансляции РНК в белок. Если, однако, SNIPR встречает немутированную последовательность, возникает несоответствие, и трансляция белка блокируется.
Вычитка РНК
Результирующая 100-кратная разница в экспрессии генов между мутировавшими и немутировавшими последовательностями РНК наблюдалась у бактерии E. coli (измеряется по продукции белка), что упрощает обнаружение точечных мутаций.
Техника основана на точном обнаружении различий в так называемой энергии связывания или гибридизации.«Обычно, когда вы думаете о спаривании оснований ДНК или РНК, это происходит через водородные связи», - говорит Грин. «Когда G соединяется с C, это 3 водородные связи, а когда A соединяется с U, это две водородные связи». Помимо точечных мутаций, анализ in vitro может обнаруживать незначительные различия в энергии связывания, когда происходят эпигенетические изменения, такие как метилирование.
Бумажный тест можно использовать в полевых условиях в регионах с ограниченными медицинскими ресурсами. Эта технология особенно перспективна для развивающихся стран, поскольку не требует сложного оборудования и может работать при температуре человеческого тела.
Первый автор Фань Хонг, ранее работавший в Институте биодизайна, а ныне стажирующийся в Гарварде, разработал компьютерные алгоритмы, которые позволяют эффективно создавать SNIPR на основе желаемых целевых последовательностей РНК.
«Чтобы сделать SNIPR простыми в использовании, мы автоматизировали процесс, чтобы каждый мог создавать их без каких-либо знаний о сворачивании РНК и взаимодействиях РНК», - говорит Хонг.«Они уже демонстрируют множество практических применений, таких как генотипирование человека, обнаружение вируса Зика и идентификация вирусного штамма».
Мощная техника - благо для науки
Идентификация конкретных штаммов имеет жизненно важное эпидемиологическое значение. Например, некоторые генетические варианты вируса Зика, по-видимому, представляют повышенный риск врожденных аномалий, в то время как циркулирующий в настоящее время коронавирус также развивается и имеет последовательность, очень похожую на коронавирус, вызвавший эпидемию атипичной пневмонии в 2002-2003 годах. Выявление воздействия этих мутировавших патогенов и их географического распространения имеет решающее значение для борьбы с этими и будущими вспышками болезней.
Метод также может дать новую надежду в борьбе с раком. Например, гранулезоклеточные опухоли, связанные с редкой и агрессивной формой рака яичников, являются результатом всего лишь одного неправильного основания из трех миллиардов пар нуклеотидов, составляющих генетический код, в то время как точечные мутации в подавляющих опухоль BRCA1 и BRCA2 гены ответственны за 6-кратное увеличение пожизненного риска рака молочной железы.
Мелкозернистая чувствительность SNIPR может различать пациентов, которые являются гетерозиготными или гомозиготными по данным мутациям, то есть, несут ли они одну или две копии мутировавшего гена на своих хромосомах, что является решающим фактором в определении уязвимости к заболеванию..
Определенные точечные мутации ВИЧ могут привести к неэффективности обычных антиретровирусных препаратов. Тест SNIPR для таких мутаций может быстро выявить эти мутации и назначить соответствующее лечение. Обычные тесты на лекарственную устойчивость к ВИЧ непомерно дороги для многих нуждающихся, их стоимость составляет более 200 долларов за образец.
Когда зонды SNIPR сочетаются с бумажными системами распознавания, потенциал быстрого, недорогого и точного обнаружения генетических точечных мутаций может быть расширен во всем мире, где такие диагностические инструменты наиболее необходимы. Кроме того, SNIPR обещают помочь исследователям понять вариации штаммов и резистентность, связанную с мутациями, к обычным терапевтическим средствам.