Мощность и удобство современных программ обработки текстов, таких как Microsoft Word, произвели революцию в наших повседневных задачах. Нужно создать быстрое резюме для новой возможности работы? Откладываете работу над итоговой курсовой, которую нужно сдать завтра? Даже составление быстрого списка продуктов. Большинство из нас полагаются на текстовые редакторы как на помощников в своей письменной жизни. Функциональность впечатляет, и, в отличие от своего архаичного предшественника, пишущей машинки, всего несколькими нажатиями клавиш можно изменить, удалить или добавить слова по желанию пользователя.
В течение многих лет исследователи искали способы имитировать эти способности, но в генетическом масштабе, чтобы точно и эффективно изменять генетическую информацию. Разработка «Microsoft Word of DNA» позволит ученым лучше изучить функционирование отдельных генов и мутаций, которые способствуют генетическим нарушениям. Благодаря одному открытию, названному CRISPR-Cas9, ученые навсегда перешли от пишущих машинок ДНК к текстовому процессору ДНК; редактировать гены с такой же легкостью, точностью и универсальностью. Эта технология завоевала огромную популярность и популярность благодаря своей гибкости и настраиваемому характеру.
Несмотря на свою мощь, CRISPR далек от совершенства и, как и любой другой метод, имеет свои недостатки и ограничения. Одно из его основных применений включает точное нацеливание и мутацию интересующего гена, чтобы он больше не функционировал в клетках определенного типа. Когда ген становится нефункциональным, можно изучить любые характерные изменения в клетке (известные как фенотипы), чтобы лучше понять, что делает этот конкретный ген. Но то, как CRISPR мутирует отдельные гены, может стать проблемой для исследователей. При помещении в клетку система CRISPR-Cas9 точно мутирует целевой ген, разрезая ДНК клетки. Затем клетка восстанавливает свою разорванную ДНК преимущественно с помощью процесса, называемого негомологичным соединением концов (NHEJ). Но этот процесс восстановления подвержен ошибкам и может вызвать изменчивость восстановленной ДНК; часто приводя к заменам, делециям или дополнениям к генетическому коду. Проблема усугубляется тем, что эффективность CRISPR может варьироваться, делая обе копии целевого гена нефункциональными, а иногда и только одну. Эти неизвестные изменения ДНК, вызванные CRISPR, могут чрезвычайно затруднить для ученых интерпретацию основной генетической причины наблюдаемого фенотипа; делает инструмент гораздо менее полезным.
В недавней публикации в Cell Reports лаборатория Танигути в Институте неврологии им. Макса Планка во Флориде (MPFI) разработала новую методологию, позволяющую связать фенотип с генотипом. Инновационно сочетая передовую технику лазерной микродиссекции с генотипированием отдельных клеток, лаборатория Танигути разработала экспериментальный конвейер, способный изучать опосредованные CRISPR эффекты в клетках, точно определяя точные изменения ДНК, которые их вызвали. Этот новый протокол откроет новые возможности для изучения нейробиологии и еще больше расширит и без того мощные возможности CRISPR.
«Хотя CRISPR точно нацелен на интересующий ген, из-за NHEJ его эффекты могут сильно различаться», - объясняет Андре Штайнеке, доктор философии, научный сотрудник и первый автор публикации. «CRISPR может оставлять клетки либо с полностью нефункционирующими генами, либо с ослабленными генами, а иногда даже усиливать их функцию. Это не такая проблема при удалении того, что вызывает очень заметный эффект в клетках, потому что вы можете легко визуализировать изменение и отсутствие белка. кодируется геном. Но некоторые, особенно гены в мозге, не имеют поразительно очевидных эффектов или их очень трудно визуализировать. Нашей целью было создать широко применимую стратегию, способную надежно определить точную генетическую причину и сопоставить ее с наблюдаемым фенотипом».
Чтобы проверить свою стратегию, команда MPFI разработала технологию CRISPR для нацеливания на ген в пирамидальных нейронах, кодирующий критический структурный белок, называемый Ankyrin-G (AnkG). Обычно белок AnkG ограничен специализированной областью нейрона, известной как начальный сегмент аксона (AIS), который отвечает за генерацию потенциалов действия. Когда AnkG удаляется, AIS претерпевает заметное утолщение, которое можно обнаружить с помощью микроскопии. Благодаря этой характерной особенности нейроны, у которых отсутствует AnkG, можно было легко отличить, и затем можно было подтвердить их точный генотип. Они обнаружили, что преимущественно нейроны, трансфицированные их зондом CRISPR, демонстрировали потерю AnkG, а также существенное утолщение AIS. Но небольшая часть нейронов, трансфицированных с помощью CRISPR, по-прежнему демонстрировала уровни AnkG и толщину AIS, сравнимую с нейронами дикого типа; демонстрируя различные эффекты CRISPR на разные клетки. Чтобы исследовать и подтвердить основные генетические причины, команда затем использовала лазерную микродиссекцию, чтобы изолировать и извлечь отдельные нейроны, чей фенотип уже был охарактеризован. После извлечения команда секвенировала каждую отдельную клетку отдельно, чтобы определить генотип. Они обнаружили, что их стратегия может надежно и воспроизводимо связать наблюдаемый фенотип с генотипом, где нейроны, лишенные AnkG, с утолщенными аксонами демонстрируют мутации потери функции в обеих копиях гена, тогда как нейроны с нормальным уровнем AnkG демонстрируют мутации только в одной копии. нейроны, трансфицированные CRISPR), или нормальные генотипы (контрольные нейроны). Затем команда подтвердила свою стратегию, используя два дополнительных гена, MeCP2 и Satb2, обнаружив, что их процесс может еще раз эффективно коррелировать наблюдаемую особенность с лежащей в основе генетикой.
«Нацеливание на гены на основе CRISPR/Cas9 открывает большие перспективы для систематического понимания молекулярных основ, лежащих в основе сборки, функционирования и дисфункции нейронных цепей», - отмечает Хироки Танигути, доктор философии. D. «Идеальное совпадение между генотипами, определенными с помощью нашего секвенирования отдельных клеток, и генотипами, полученными в результате оценки фенотипа, предполагает, что наш подход представляет собой новый мощный метод, способный повысить надежность и расширить применение методов, основанных на CRISPR».