Впервые в мире японские ученые использовали революционный инструмент редактирования генома CRISPR или CRISPR/Cas9 для изменения цвета цветка декоративного растения. Исследователи из Университета Цукуба, Национальной организации сельскохозяйственных и пищевых исследований (NARO) и Городского университета Йокогамы, Япония, изменили цвет цветка традиционного японского садового растения, японской ипомеи (Ipomoea nil или Pharbitis nil), с фиолетового на белый., нарушив один ген. Это исследование подчеркивает огромный потенциал системы CRISPR/Cas9 для изучения и манипулирования генами в садовых растениях.
Ипомея японская, или асагао, была выбрана для этого исследования, поскольку она является одним из двух традиционных образцовых садовых растений в Национальном проекте биоресурсов в Японии (NBRP). Уже проведены обширные генетические исследования этого растения, секвенирован его геном и установлены методы переноса ДНК. Кроме того, поскольку общественная озабоченность генетическими технологиями, такими как CRISPR/Cas9, в настоящее время является социальной проблемой в Японии, исследования с использованием этого популярного и широко выращиваемого растения могут помочь просвещению общественности по этой теме.
Исследовательская группа нацелилась на единственный ген, дигидрофлавонол-4-редуктазу-B (DFR-B), кодирующий фермент биосинтеза антоцианов, который отвечает за цвет стеблей, листьев и цветов растения. Два других, очень близкородственных гена (DFR-A и DRF-C) расположены бок о бок, рядом с DFR-B. Таким образом, задача состояла в том, чтобы конкретно и точно воздействовать на ген DFR-B, не изменяя другие гены. Была использована система CRISPR/Cas9, так как в настоящее время это наиболее точный метод редактирования генов.
Система CRISPR (кластеризованные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы)/Cas9 основана на бактериальном защитном механизме. Он состоит из двух молекул, которые изменяют последовательность ДНК. Cas9, фермент, разрезает две нити ДНК в точном месте, чтобы ДНК можно было добавить или удалить. Cas9 направляется в правильное место с помощью гРНК или направляющей РНК, небольшой части РНК, которая была разработана так, чтобы быть комплементарной последовательности ДНК-мишени. Cas9 разрезает две нити ДНК в нужном месте, позволяя удалить и/или добавить ДНК.
Как сообщалось 30 августа 2017 года в Scientific Reports, короткая последовательность ДНК в гене DFR-B японской ипомеи была выбрана в качестве мишени для системы CRISPR/Cas9. Эта последовательность содержит активный сайт фермента, продуцируемого геном DFR-B. Следовательно, нарушение этой последовательности должно деактивировать фермент, что приведет к отсутствию красящего пигмента, антоцианина. Система CRISPR/Cas9 была введена в культивируемые ткани эмбрионов японской ипомеи с использованием способности переноса ДНК растительной бактерии Rhizobium. Как и ожидалось, фермент DFR-B был успешно инактивирован, в результате чего примерно 75% трансгенных растений имели зеленые стебли и белые цветки. Нетрансформированные растения с активным ферментом имели фиолетовые стебли и цветки. Эти изменения в цвете стебля наблюдались очень рано в процессе культивирования ткани. Серия генетических анализов подтвердила, что целевая последовательность ДНК была изменена в трансгенных растениях либо с инсерциями ДНК, либо с делециями в обеих копиях гена DFR-B (так называемые биаллельные мутанты). Другие родственные гены, DFR-A и DFR-C, были исследованы, и мутаций обнаружено не было, что подтверждает высокую специфичность системы CRISPR/Cas9.
Затем исследователи изучили наследование мутаций, вызванных CRISPR/Cas9, путем анализа растений следующего поколения. Эти растения выглядели точно так же, как их родители. Среди этих растений были некоторые без каких-либо признаков введенной ДНК. Это поднимает некоторые интересные вопросы с точки зрения регулирования генетически модифицированных организмов (ГМО), поскольку эти растения следующего поколения считаются трансгенными на основе определений, основанных на процессах (как они были получены), и нетрансгенными, на основе продуктов. на основе определений (наличие чужеродной ДНК в конечном продукте).
Эта технология также чрезвычайно полезна для подтверждения функции генов. В экспериментах 1930-х и 1990-х годов использовались методы «прямого» генетического скрининга, чтобы найти гены, ответственные за окраску цветков японской ипомеи. Описанная здесь система CRISPR/Cas9 представляет собой «обратный» генетический подход, используемый для выяснения того, как выглядит организм после разрушения известного гена, и подтверждает, что ген DFR-B является основным геном, ответственным за окраску японской ипомеи. растения.
В настоящее время технология CRISPR/Cas9 не эффективна на 100%, то есть не все целевые растения будут трансгенными. Однако частота мутаций в этом исследовании, 75%, была относительно высокой. Это одна из причин, по которой данное исследование поможет тем, кто интересуется модификацией цвета и формы цветов с помощью системы CRISPR/Cas9 в декоративных цветах или овощах.
История японской ипомеи началась в 8 веке нашей эры, когда дикорастущие растения с голубыми цветками были завезены в Японию из Китая. В 1631 году в Японии была нарисована первая белоцветковая японская ипомея. То, на что природе потребовалось почти 850 лет, потребовалось менее одного года с использованием системы CRISPR/Cas9, что свидетельствует как о ее мощи, так и о ее потенциале.