Секвенирование следующего поколения - способность секвенировать миллионы или миллиарды небольших фрагментов ДНК параллельно - произвело революцию в биологических науках, сыграв важную роль во всем: от обнаружения мутаций, вызывающих болезни человека, до определения того, как недавно обнаруженные животное вписывается в дерево жизни. Но исследование, опубликованное сегодня в журнале Scientific Reports, показывает, что излюбленный метод секвенирования для измерения микробного биоразнообразия не так точен, как считалось раньше.
Исследовательская группа, возглавляемая учеными из Американского музея естественной истории, Городского университета Нью-Йорка (CUNY), Weill Cornell Medicine, Universidade Estadual de Maringá, Instituto Cesumar de Ci?ncia, Tecnologia e Inovação, и Университет Иллинойса в Спрингфилде сравнили два метода секвенирования следующего поколения, называемые ампликон и дробовик, на образцах воды из четырех основных речных пойменных систем Бразилии. Менее 50 процентов типов - категории для очень широкой группы родственных организмов - идентифицированных с помощью секвенирования ампликонов, были извлечены из секвенирования дробовика, что бросает вызов догме о том, что дробовик восстанавливает большее разнообразие, чем подходы, основанные на ампликоне. Секвенирование ампликонов также выявило на 27% больше семей.
«В качестве примера потенциального воздействия нашего открытия вы можете подумать о типе Cnidaria, который содержит все мировые анемоны, кораллы и медузы», - сказал старший автор Мерсер Р. Брюглер, научный сотрудник отдела зоологии беспозвоночных Музея и доцент Технологического колледжа Нью-Йорка, CUNY. «Один метод найдет представителя этой группы, а другой нет. Типы - это огромные группы, которые полностью отсутствуют в данных секвенирования методом дробовика».
При использовании ампликона один и тот же ген (в данном случае 16S рибосомная РНК) секвенируется из каждого образца, в то время как фрагменты ДНК секвенируются случайным образом при работе методом дробовика. Хотя ампликон был традиционной рабочей лошадкой для изучения микробной жизни, всплеск исследований человеческого микробиома вдохновил многих ученых переключиться на дробовик, который дешевле и генерирует больше генетической информации. Предыдущие исследования микробиома человека, сравнивающие эти два метода, также показали, что дробовик дает эквивалентные, если не лучшие результаты. Поэтому исследователи, участвовавшие в этом бразильском исследовании воды, были удивлены, когда обнаружили нечто совершенно иное.
«После нашей предыдущей публикации об этих образцах мы переключились с ампликона на дробовик с намерением просто получить образцы большего размера», - сказал ведущий автор Майкл Тесслер, недавний выпускник Школы Ричарда Гилдера при Музее.«Мы просто случайно сравнили два метода, потому что у нас были данные, так почему бы и нет? Мы думали, что данные дробовика, по крайней мере, будут равны, если не ошеломят данные ампликона».
Они думали, что из-за огромной разницы в количестве генетических данных, которые генерирует каждый метод: ампликон дал им около 346 000 фрагментов пригодной для использования ДНК, а дробовик - около 575 миллионов прочтений. Тем не менее, ампликон выявил более чем вдвое большее количество типов.
«Это похоже на то, как рыбак с одной удочкой ловит больше рыбы, чем коммерческий траулер», - сказал Тесслер.
Так почему же секвенирование ампликонов, которое многие считают методом старения, в данном случае превосходит дробовик? Shotgun секвенирует случайные фрагменты ДНК, а не один последовательный ген, поэтому исследователям требуется надежная база данных, которую они могут использовать для сопоставления последовательностей с организмом. Если данных для этого организма не существует, вы получите только самое близкое совпадение или вообще не найдете совпадений. Для этого исследования, в котором рассматриваются малоизученные пресноводные бактерии, база данных чрезвычайно слаба.
«Вывод состоит в том, что если вы работаете в более удаленной системе, вам нужно проверить свои методы», - сказал Тесслер.
Брюглер добавил: «Исследования, проведенные на сегодняшний день, в которых для получения оценок микробного разнообразия использовалось только дробовик, следует рассматривать с осторожностью, поскольку они, вероятно, недооценивают истинное разнообразие».