Недавние достижения в области технологий визуализации позволили получить беспрецедентное представление о биологических событиях, происходящих в живых организмах. Исследователи регулярно снимают фильмы о таких процессах, как деление и дифференцировка клеток в нейроны, мышцы и кожу в чашке Петри или в крошечных эмбрионах, таких как червь C. elegans. Но ученые часто испытывают трудности со сбором аналогичных данных для более крупных особей, таких как рыбки данио или плодовые мушки, эмбрионы которых примерно в 1000 раз больше и обладают сложными оптическими свойствами. Новый «умный» световой микроскоп, разработанный в исследовательском кампусе Janelia Медицинского института Говарда Хьюза, решает эту проблему, непрерывно анализируя образец и регулируя его настройки для оптимизации качества изображения.
«Микроскоп умен в том смысле, что он сам управляет экспериментом», - объясняет руководитель группы Janelia Филипп Келлер. «Не человек указывает микроскопу, как именно делать снимки. Микроскоп сам определяет, что ему нужно сделать, чтобы получить четкое изображение».
Келлер сотрудничал с учеными из Института молекулярной клеточной биологии и генетики им. Макса Планка в Дрездене, Германия, и исследователями из Coleman Technologies Incorporated на Ньютаун-сквер, штат Пенсильвания, для создания нового микроскопа, который описан в статье, опубликованной в Интернете. 31 октября 2016 г. в журнале Nature Biotechnology. В публикации представлено подробное описание прибора, а также исходный код его программного обеспечения, который также находится в открытом доступе на Github.
В 2012 году Келлер возглавил группу, которая разработала световой листовой микроскоп с одновременным многоракурсным (SiMView), который позволяет ученым получать изображения живых организмов на высоких скоростях в течение длительных периодов времени, не вмешиваясь в процессы, в которых они находились. наблюдая. Микроскоп был основан на методах, разработанных Келлером вместе с коллегами из Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге, Германия, для решения одной из проблем, связанных с обычной световой микроскопией: повреждающего воздействия света на образец. Келлер и его коллеги уменьшили это повреждение, освещая только тонкий срез образца сканируемым листом лазерного света, в то время как детектор регистрировал освещенную часть образца..
Микроскоп SiMView был быстрым и мог регистрировать динамические процессы в небольших прозрачных образцах, таких как отдельные клетки в культуре или на поверхности многоклеточных организмов. Но он изо всех сил пытался получить изображения с высоким разрешением более крупных и оптически сложных образцов, таких как целые эмбрионы.
Эта проблема напрямую связана с ключевым требованием в световой микроскопии: чтобы световой лист, освещающий образец, и фокальная плоскость системы обнаружения были идеально копланарны. «Они должны точно совпадать», - объясняет Келлер. «Если они каким-либо образом отклоняются геометрически, это похоже на расфокусировку изображения».
Поскольку живые организмы неоднородны физически или химически, траектория лазерного луча может искажаться при прохождении через образец, что затрудняет поддержание совмещения светового листа и детектора. Чем больше выборка, тем хуже эффект.
Келлер решил эту проблему, сделав микроскоп умнее, чтобы он мог приспосабливаться к меняющемуся образцу. «Мы работали с большим количеством крупных многоклеточных организмов, и нам нужен был способ, чтобы микроскоп адаптировался к образцу и проводил сам эксперимент», - говорит Келлер. «Это было чисто по необходимости, что мы начали проект."
Келлеру и его сотрудникам потребовалось около трех лет, чтобы усовершенствовать технологию, которую они называют инфраструктурой AutoPilot. Ученый-исследователь Janelia Рагхав Чхетри сосредоточился на оборудовании, добавив микроскопу больше степеней свободы, например, возможность вращать световой лист в пространстве, а Лоик Ройер, научный сотрудник лаборатории Джина Майерса в Институте молекулярно-клеточной биологии им. Макса Планка, руководил разработкой программного обеспечения.
Программное обеспечение работает, анализируя изображения с микроскопа в режиме реального времени, определяя, как улучшить качество изображений, а затем настраивая правильные параметры на микроскопе. «Система понимает взаимосвязь между всеми различными переменными, и когда она замечает, что что-то не так, она может определить, какую ручку повернуть, чтобы исправить ситуацию», - объясняет Ройер. Поскольку световые микроскопы собирают трехмерные изображения образца каждые несколько секунд или сотни миллисекунд, расчеты, анализ и настройки выполняются в течение короткого времени простоя микроскопа.
Ученые из Джанелии Билл Лемон и Инан Ван протестировали структуру AutoPilot на различных модельных системах, включая дрозофилу и рыбок данио. Эти эксперименты продемонстрировали улучшение пространственного разрешения и уровня сигнала в 2-5 раз.
Среда не только позволяет просматривать клеточные и даже субклеточные структуры, которые невозможно получить обычными методами, но и очень удобна для пользователя. Высокий уровень автоматизации инструментов AutoPilot гарантирует, что любой пользователь микроскопа, даже не имеющий технических знаний или опыта в световой микроскопии, сможет последовательно и без особых усилий получать оптимальные данные изображения.
«Мы хотели сделать микроскоп как можно более мощным, но при этом максимально простым в использовании», - говорит Келлер. «Фреймворк делает это, помогая пользователю убедиться, что эксперимент настроен правильно, а также убедиться, что пользователь может легко и воспроизводимо создавать изображения оптимального качества в каждом отдельном эксперименте."
Видео: