Микробные патогены можно однозначно диагностировать всего за 24 часа с помощью высокопроизводительного секвенирования их генетического состава и специальных алгоритмов оценки биоинформатики. Исследователи Фраунгофера подтвердили это в клиническом исследовании пациентов с сепсисом. Исследователи представляют диагностическую платформу NGS на выставке Medica в Дюссельдорфе с 14 по 17 ноября 2016 г.
По оценкам, только в Германии около 150 000 человек ежегодно заболевают сепсисом; несмотря на достижения медицины, от 30 до 50 процентов пациентов по-прежнему умирают от последствий (см. вставку). Одна из причин высокой смертности: диагноз часто ставится слишком поздно для спасительной терапии антибиотиками, которые борются только с конкретным возбудителем. Обычно возбудителей сепсиса выявляют с помощью так называемых культур крови, при которых в лаборатории культивируют патогенный организм из образцов крови больных. Здесь проходит от двух до пяти дней, прежде чем возбудители размножатся и станет известен результат.
Благодаря быстрому прогрессу в анализе нуклеиновых кислот доступные в настоящее время высокопроизводительные технологии (NGS, секвенирование следующего поколения) позволяют всего за несколько часов секвенировать полный геном организмов и сравнивать их с известными последовательности генов (см. вставку).
На основе этих технологий исследователи из Фраунгоферовского института межфазной инженерии и биотехнологии IGB разработали альтернативную диагностическую платформу для сепсиса. Это позволяет им идентифицировать бактерии, грибки или вирусы напрямую с помощью анализа последовательности их ДНК без необходимости предварительного культивирования патогенов в лаборатории. В клиническом исследовании, проведенном учеными в сотрудничестве с университетской клиникой Гейдельберга, они подтвердили свой диагностический метод на образцах крови пациентов с сепсисом. Здесь они идентифицировали инфекционные микроорганизмы с помощью высокопроизводительного секвенирования ДНК, свободно циркулирующей в крови (CNAPS, Циркулирующие нуклеиновые кислоты в плазме и сыворотке).
Быстрая одноэтапная идентификация бактерий, вирусов и грибков
«С помощью нашего диагностического секвенирующего метода нового поколения мы смогли всего за 24 часа определить, какими патогенами были инфицированы пациенты», - д-р Кай Сон, глава рабочей группы «Функциональная геномика» Fraunhofer IGB, объясняет. «В результате прямого секвенирования ДНК образца крови больше не требуется трудоемкий этап культивирования микроорганизмов в лаборатории. Таким образом, мы также можем идентифицировать те патогены, которые труднее выращивать в условиях лабораторных условиях», - говорит доктор. Сон.
Еще одно преимущество: если образцы содержат не только ДНК бактерий, но и ДНК вирусов или грибков, они также секвенируются, анализируются и идентифицируются. «Например, в нашем исследовании нам удалось идентифицировать вирусный возбудитель как причину заболевания пациента. Однако посев крови пациента показал отрицательный результат, поскольку здесь могут быть обнаружены только бактерии», - поясняет ученый.
Метод дает одновременно качественные и количественные результаты. «С нашей технологией мы можем распознать на основе количества фрагментов генома, какие патогены сильно размножились у пациента и которые уже реагируют на терапию», - отмечает доктор Зон. Это позволяет врачу немедленно проводить дальнейшие целенаправленные терапевтические мероприятия вместо того, чтобы тратить драгоценное время на использование неподходящего лекарства.
Алгоритмы биоинформатики идентифицируют соответствующие патогены
Более 99 процентов ДНК, свободно циркулирующей в плазме крови, имеют человеческое происхождение, поэтому идентификация возбудителей сепсиса напоминает пресловутый поиск иголки в стоге сена. Поэтому исследователи используют специальные программы для сравнения секвенированных фрагментов с базой данных генома, в которую они ввели общедоступные последовательности ДНК бактерий, грибков и вирусов.
Однако не каждый идентифицированный микроорганизм обязательно также является причиной сепсиса. Таким образом, одной из самых больших проблем при оценке данных секвенирования является оценка того, отличается ли результат от статистически ожидаемого результата. Чтобы иметь возможность ответить на этот решающий вопрос, Филип Стивенс, специалист по биоинформатике в команде, разработал специальный алгоритм в своей докторской диссертации в Венском центре интегративной биоинформатики (CIBIV) и Институте межфазной инженерии процессов и плазменных технологий (IGVP) Штутгартского университета.
Основным элементом диагностического метода, на который ожидается получение патента, является сравнение результатов секвенирования с секвенированными фрагментами крови здоровых испытуемых. «Таким образом, алгоритм предоставляет нам балл, с помощью которого мы можем оценить значимость данных и исключить микробный «фоновый шум», то есть безвредные бактерии нашей кожи или кишечной флоры, как диагностически значимые патогены», - объясняет Стивенс. Клиническое исследование показало, что компьютерные диагнозы тесно коррелируют с диагнозами культуры крови.
Выявление устойчивости к антибиотикам
Устойчивость бактерий к обычно используемым антибиотикам, таким как метициллин, ванкомицин или тетрациклин, приобретается через соответствующие гены устойчивости. Поэтому высокопроизводительное секвенирование позволяет в одном и том же анализе идентифицировать как биологические виды возбудителя, так и гены его устойчивости. Это также помогает врачу, лечащему пациента, начать целенаправленную терапию.
Дальнейшее развитие
Чтобы еще больше сократить время от образца до окончательного диагноза, ученые изучают, как этот метод можно перенести на недавно разработанные платформы для секвенирования. Например, с помощью секвенирования на основе нанопор, которое в настоящее время находится на стадии испытаний, ДНК можно секвенировать за еще более короткое время, чем раньше. Таким образом, в будущем специфическая диагностика инфекций станет возможной в течение шести-восьми часов. В 2017 году ученые Фраунгофера планируют провести многоцентровое проверочное исследование совместно с ведущими клиническими партнерами.
Fraunhofer IGB представляет диагностику сепсиса с помощью секвенирования нового поколения на выставке Medica в Дюссельдорфе с 14 по 17 ноября 2016 г. на совместном стенде Fraunhofer.