Сделав серию снимков с разрешением, близким к атомному, ученые Корнельского университета и Гарвардской медицинской школы шаг за шагом наблюдали, как бактерии защищаются от чужеродных захватчиков, таких как бактериофаг, вирус, поражающий бактерии.
В процессе, который они наблюдали, используются сайты CRISPR (сгруппированные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы), где клеточная ДНК может быть вырезана для вставки дополнительной ДНК.
Биологи используют CRISPR для генно-инженерных экспериментов, но клетки, возможно, развили этот механизм как часть защитной системы. Клетка использует эти места для хранения молекулярных воспоминаний о захватчиках, чтобы их можно было выборочно уничтожить при следующей встрече.
«Иммунная система жука работает так же эффективно, как и наша, за исключением того, что наша система работает на уровне распознавания белков, тогда как CRISPR работает на уровне распознавания нуклеиновых кислот», - объяснил Айлонг Ке, профессор молекулярной биологии и генетики.
При первом столкновении бактерии вставляют часть ДНК захватчика в свой собственный геном в месте CRISPR. При необходимости РНК-транскрипт хранимой ДНК, называемый направляющей РНК, может быть собран с другими белками в комплекс, называемый каскадом (ассоциированный с CRISPR комплекс для противовирусной защиты). Система настолько эффективна и точна, что исследователи придумали, как переоборудовать ее для приложений редактирования генома, чтобы вносить изменения в точные участки ДНК. «Революция CRISPR захлестывает биологию, пока мы говорим», - сказал Ке.
В предыдущем исследовании Ке определил функцию комплексов белок-РНК, участвующих в этом процессе, и использовал оборудование рентгеновской кристаллографии Корнеллского высокоэнергетического синхротронного источника (CHESS) для определения их структуры. Ибэй Сяо, научный сотрудник лаборатории Кэ, шаг за шагом разработал весь процесс иммунитета. «Следующий шаг - сделать структурные снимки этих шагов, чтобы создать фильм высокого разрешения о том, что происходит», - сказал Ке.
Ке сотрудничал с Маофу Ляо, доцентом кафедры клеточной биологии Гарвардской медицинской школы, который является экспертом в использовании криоэлектронного микроскопа для определения структур макромолекул с высоким разрешением, замороженных в тонком слое льда. Работая с бактериями Thermobifida fusca, используемыми при ферментации, лаборатория Ке подготовила образцы, представляющие различные стадии иммунного ответа. Ляо и его научный сотрудник Мин Луо заморозили эти образцы и сделали снимки с высоким разрешением на каждом этапе. Исследование было сосредоточено на конкретной версии защиты, связанной с CRISPR, известной как тип I-E..
«Мы примерно знали, как это работает, но без структур у нас не было деталей», - сказал Ке. «Картинка стоит тысячи слов».
«Ученые выдвинули гипотезу о существовании этих состояний, но им не хватало визуальных доказательств их существования», - сказал Луо. «Видеть - значит верить».
Выводы, опубликованные 29 июня в журнале Cell, предоставляют структурные данные, которые могут повысить эффективность и точность биомедицинских операций CRISPR. Аспекты этого защитного механизма, особенно то, как он ищет свои ДНК-мишени, были неясны и вызвали опасения по поводу непреднамеренных побочных эффектов и безопасности использования механизма CRISPR-Cas для лечения заболеваний человека.
«Чтобы решить проблемы специфичности, нам нужно понять каждый шаг формирования комплекса CRISPR», - сказал Ляо.
«Чтобы применить CRISPR в медицине, мы должны быть уверены, что система случайно не нацелится на неправильные гены», - сказал Ке. «Наш аргумент заключается в том, что система типа I потенциально более точна, чем CRISPR-Cas9, потому что она проверяет более длинный участок последовательности перед действием, а система делит поиск цели и деградацию на два этапа со встроенными функциями безопасности между ними.”
CRISPR типа I пока предлагает ограниченную полезность для точного редактирования генов, но его можно использовать в качестве инструмента для борьбы с устойчивыми к антибиотикам штаммами бактерий.
Ке и Сяо написали в соавторстве с Ильей Финкельштейном, доцентом кафедры молекулярной биологии Техасского университета в Остине, еще одну статью в том же выпуске Cell, чтобы описать, как Cascade ищет цели на уровне одной молекулы.