Один из методов, используемых в генной инженерии - процесс искусственного изменения генома живого организма - использует так называемую нуклеазную систему CRISPR-Cas9. Используя эту систему, ДНК клетки можно разрезать в нужном месте, где гены могут быть удалены или добавлены. Выбор места разреза осуществляется с помощью молекулы «направляющей РНК», связанной с белком Cas9. Теперь группа исследователей под руководством Микихиро Шибата из Канадзавского университета и Осаму Нуреки из Токийского университета визуализировала динамику комплекса CRISPR-Cas9, в частности, как он разрезает ДНК, предоставив ценную информацию о ДНК, опосредованной CRISPR-Cas9. механизм расщепления.
Для своих визуализационных исследований ученые использовали высокоскоростную атомно-силовую микроскопию (HS-AFM), метод визуализации поверхностей. Поверхность исследуют, перемещая по ней крошечный кантилевер; сила, действующая на зонд, может быть преобразована в меру высоты. В результате сканирования всей поверхности получается карта высот образца. Высокоскоростная экспериментальная установка Шибаты и его коллег позволила чрезвычайно быстро повторять сканирование биомолекул, участвующих в молекулярном действии ножниц..
Во-первых, ученые сравнили Cas9 без и с прикрепленной РНК (Cas9-РНК). Они обнаружили, что первая способна гибко принимать различные конформации, в то время как вторая имеет фиксированную двухлепестковую структуру, что подчеркивает способность направляющей РНК конформационной стабилизации. Затем Шибата и его коллеги рассмотрели, как стабилизированный комплекс Cas9-РНК воздействует на ДНК. Они подтвердили, что он связывается с предварительно выбранным сайтом мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM) в ДНК. PAM представляет собой короткую последовательность нуклеотидов, расположенную рядом с целевым участком ДНК, которая комплементарна направляющей РНК.
Кино с высокой скоростью, снятое исследовательской группой, также показало, что нацеливание («допрос ДНК») достигается за счет трехмерной диффузии комплекса Cas9-РНК. Наконец, исследователям удалось визуализировать динамику самого процесса расщепления: они наблюдали, как область «молекулярных ножниц» претерпевает конформационные флуктуации после того, как Cas9-РНК локально раскручивает двухцепочечную ДНК.
Работа Шибаты расширяет наше понимание механизма редактирования генома CRISPR-Cas9. По словам исследователей: «… это исследование предоставляет беспрецедентные подробности о функциональной динамике CRISPR-Cas9 и подчеркивает потенциал HS-AFM для выяснения механизмов действия РНК-управляемых эффекторных нуклеаз из различных систем CRISPR-Cas."
CRISPR-Cas9
CRISPR, сокращение от «короткие палиндромные повторы, сгруппированные с регулярными промежутками», относится к набору последовательностей бактериальной ДНК, содержащих фрагменты ДНК вирусов, ранее атаковавших бактерии. Эти фрагменты используются бактериями для предотвращения дальнейших атак тех же вирусов. «Cas» относится к CRISPR-ассоциированным генам; «Cas9» - это CRISPR-ассоциированный белок с двумя нуклеазными доменами (Нуклеаза - это фермент, способный расщеплять нуклеиновые кислоты, органические молекулы, присутствующие в ДНК и РНК).
В последние годы был разработан генно-инженерный метод, в котором комплекс CRISPR-Cas9 действует как «молекулярные ножницы»; Нуклеаза Cas9 связывается с направляющей молекулой РНК, которая содержит информацию о целевом участке ДНК. Используя высокоскоростную атомно-силовую микроскопию, Микихиро Шибата из Канадзавского университета и его коллеги теперь очень подробно изучили динамику комплекса CRISPR-Cas9.
Атомно-силовая микроскопия
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) - это метод визуализации, при котором изображение формируется путем сканирования поверхности очень маленьким наконечником. Горизонтальное сканирующее движение наконечника контролируется пьезоэлектрическими элементами, а вертикальное движение преобразуется в профиль высоты, что приводит к распределению высоты поверхности образца. Поскольку в методике не используются линзы, ее разрешающая способность не ограничивается так называемым дифракционным пределом. В высокоскоростной установке АСМ можно использовать для создания видеороликов об эволюции образца в реальном времени. Высокоскоростная АСМ успешно использовалась для изучения динамики белков, например, ходьбы миозина V по актиновой нити, фотоиндуцированного конформационного изменения бактериородопсина и деградации целлюлозы. Шибата и его коллеги теперь применили высокоскоростной метод АСМ для визуализации динамики расщепления ДНК с помощью CRISPR-Cas9.