CRISPR-Cas9 - это революционный инструмент отчасти из-за его универсальности: созданный бактериями для пережевывания вирусов, он одинаково хорошо работает в клетках человека, выполняя всевозможные генетические трюки, включая вырезание и склеивание ДНК, создание точечных мутации и активация или инактивация гена.
Калифорнийский университет в Беркли, исследователи сделали его еще более универсальным, предоставив ему переключатель «вкл», позволяющий пользователям отключать редактор гена Cas9 во всех клетках, кроме назначенной цели.
Переработанный фермент Cas9, который исследователи называют ProCas9, полностью функционален, за исключением того, что содержит участок белка, который необходимо отрезать, прежде чем фермент сможет связать и разрезать ДНК. Если ученые вставят короткий фрагмент белка, который может быть расщеплен только определенным ферментом, например, используемым исключительно раковыми клетками, инфекционным вирусом или бактерией, этот фермент станет триггером для включения Cas9.
ProCas9, по сути, «чувствует» тип клетки, в которой он находится, на основе фермента, расщепляющего белок, так называемой протеазы.
«Это дополнительный уровень безопасности, который вы можете надеть на молекулу, чтобы обеспечить точное разрезание», - сказал Дэвид Сэвидж, доцент кафедры молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета в Беркли.
Он также наделяет белок Cas9 программируемыми входами в дополнение к его программируемым выходам.
«Существует множество протеаз, которые регулируют сигнальные пути в клетках, превращают нормальные клетки в раковые и участвуют в инфицировании патогенами», - сказал Сэвидж.«Если мы сможем почувствовать эти сигналы, мы сможем подключиться к этим важным путям и соответствующим образом отреагировать на них».
В ходе исследования Сэвидж и его коллеги продемонстрировали протеазный контроль над Cas9, сделав его чувствительным как к растительным, так и к человеческим вирусам, таким как вирус Западного Нила. Они считают, что в будущем подобная технология может быть использована для переноса бактериальной иммунной системы CRISPR-Cas9 в растения, чтобы помочь им противостоять вредоносным вирусным патогенам.
Исследование ученых из Калифорнийского университета в Беркли и Института Гладстона в Сан-Франциско будет опубликовано в Интернете 10 января в журнале Cell.
Разделение Cas9 на самое необходимое
Первоначальная цель исследования Сэвиджа состояла в том, чтобы сократить белок Cas9 - «ножницы», которые на самом деле разрезают ДНК для редактирования генов - до самых простых частей, чтобы получить наиболее надежный редактор генов. Чем он проще, тем проще с ним работать и переправлять в ячейки.
«Мы знаем, что белки Cas сложны и что они имеют все виды регуляции, которые имеют решающее значение для их функционирования в бактериальной иммунной системе», - сказал он.«Общая цель нашей работы - приручить их для использования людьми и убрать ненужные вещи, не относящиеся к редактированию генома».
В частности, он хотел перепроектировать Cas9, чтобы к нему было легче присоединять другие белки. Это позволило бы Cas9 переносить белки с различными функциями в нужное место ДНК. Они известны как слитые белки, многообещающие варианты которых могут изменять экспрессию генов или, в случае технологии, известной как редактирование оснований, изменять одно основание или нуклеотид в ДНК с высокой точностью.
Техника, которую он использовал для реинжиниринга Cas9, называемая круговой перестановкой, никогда не применялась к такому сложному белку, как Cas9. Круговая перестановка включает в себя взятие аминокислотной цепочки белка Cas9 и ее разрезание, изменение порядка двух сегментов, а затем позволяет ей свернуться в новую трехмерную конфигурацию. Он сделал это для всех возможных способов разрезания белка на две части.
Хотя вы можете подумать, что это полностью разрушит белок, примерно в 10 процентах случаев новый белок все еще работал, как если бы он просто переставил белковые субъединицы другим способом, который не повлиял на их функционирование. Это может сработать, потому что, как показали изобретатель CRISPR-Cas9 Дженнифер Дудна и ее коллеги, белковый комплекс Cas9 очень гибок и перемещается, когда он захватывает направляющую РНК, связывается с ДНК и перемещается в положение, позволяющее разрезать нити ДНК.
Сэвидж в настоящее время исследует некоторые перестройки Cas9, которые могут обеспечить лучший каркас для слитых белков, приближая их к цепи ДНК, на которую они нацелены.
В процессе перестройки каркаса Cas9 он по счастливой случайности обнаружил, что способ, которым он повторно соединил два белковых сегмента, имел значение.
«Когда мы разрезали белок и переместили старый фрагмент в новое место внутри белка, система стала очень чувствительной к тому, как вы соединили два фрагмента вместе», - сказал он. «Мы поняли, что можем использовать эту чувствительность, чтобы сконструировать белок с сайтами, распознающими протеазы».
Исследование показывает, что «мы не зациклены на том, что природа дала нам в отношении белков для редактирования генома», - сказал он.«Эти белки могут быть тщательно оптимизированы и превращены в каркасы, не встречающиеся в природе, но обладающие нужными свойствами для использования в клетках человека».