Пара биологов растений из Института трансформирующих биомолекул (ITbM) Университета Нагои опубликовала в журнале Plant and Cell Physiology сообщение о разработке нового вектора (носителя для передачи генетической информации). чтобы нокаутировать гены-мишени в модельном растении Arabidopsis thaliana высокоэффективным и наследуемым образом.
Геном состоит из полного набора ДНК организма, включая его гены, которые содержат всю информацию, необходимую для развития и поддержания организма. Геномная инженерия, которая включает в себя специфическую модификацию частей генома путем удаления, добавления и изменения участков последовательности ДНК, является быстро развивающимся методом. На данный момент система CRISPR (короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами)/Cas9 (CRISPR-ассоциированный белок 9) является одним из самых популярных методов генетической манипуляции благодаря своей простоте, универсальности и эффективности.
Тем не менее, мутация, вызывающая эффективность CRISPR/Cas9 по отношению к модельному растению, Arabidopsis thaliana, до сих пор оставалась несколько низкой. Это связано с тем, что триггер генной мутации активируется на более поздних стадиях развития клеток. Поэтому для получения желаемых видов растений с нокаутом целевого гена потребовалось значительное количество времени, усилий и видов растений.
CRISPR/Cas9 состоит из двух ключевых молекул: части РНК, называемой направляющей РНК (гРНК), и фермента, называемого Cas9. Cas9 действует как молекулярные ножницы, которые могут разрезать обе нити ДНК в определенном месте генома, так что последовательности ДНК могут быть добавлены или удалены в этом положении. С другой стороны, гРНК состоит из предварительно сконструированной последовательности РНК (длиной около 20 оснований), которая расположена внутри более длинного каркаса РНК. Каркас РНК связывается с ДНК, а предварительно разработанная последовательность РНК направляет белок Cas9 к определенной части генома, чтобы Cas9 мог разрезаться в нужном положении.
Используя промотор гена РИБОСОМНОГО БЕЛКА S5A (RPS5A), который экспрессируется на ранней эмбриональной стадии в растительных клетках, мы смогли с высокой эффективностью индуцировать белок Cas9 для нокаута генов в яйцеклетках, - говорит Хироки Цуцуи, первый автор этого исследования. «Этот промотор RPS5A активен в яйцеклетках, и мы решили назвать этот молекулярный инструмент вектором pKAMA-ITACHI Red (pKIR), который может редактировать геном растения с высокой эффективностью по сравнению с промотором 35S, обычно используемым в растениях», - продолжает он..
«Кама-итачи» имеет японское значение трех существ, похожих на ласку, где первая ласка нацеливается на человека и спотыкается о него, затем вторая ранит человека, разрезая его, а третья исцеляет человека.. Это похоже на процесс системы CRISPR/Cas9 в отношении ДНК, где CRISPR нацеливается, Cas9 разрезает и индуцирует репарацию конкретной интересующей последовательности ДНК.
«Благодаря возможности эффективно нокаутировать целевой ген в Arabidopsis thaliana, мы считаем, что это многообещающий метод для выяснения генетических функций растений», - говорит Тецуя Хигасияма, профессор и руководитель этого исследования. «Мы надеемся, что сможем применить эту методологию для редактирования генома сельскохозяйственных культур, таких как Brassica napus, для ускорения их роста и создания различных линий растений».
Система CRISPR/Cas9 работает, отключая определенный ген, чтобы исследовать его функцию. В модельном растении Arabidopsis thaliana, поскольку белок Cas9 экспрессируется на более поздней стадии развития клетки, степень нокаута гена варьируется в зависимости от ткани. Таким образом, эффективность мутаций генома была относительно низкой.
Например, когда обычно используемый для растений промотор 35S использовался для экспрессии белка Cas9 в Arabidopsis thaliana, хотя в листьях наблюдались частые нокауты генов, лишь некоторые из них были обнаружены в цветках. Это свидетельствует о том, что эффективность нокаутной мутации гена-мишени в репродуктивных клетках цветков была относительно низкой. Впоследствии нокаутную мутацию было трудно передать дочерним клеткам в следующем поколении.
Чтобы решить эту проблему, группа Хигасиямы решила экспрессировать белок Cas9 в яйцеклетке и в клетке на ранней стадии развития, чтобы повысить эффективность нокаута генов.
Поскольку яйцеклетки и оплодотворенные яйцеклетки (зиготы) являются источником для развития и роста растительных клеток, мы пришли к выводу, что если редактирование генома проводить на ранней стадии, генная мутация может происходить с высокой эффективностью и может быть унаследовано следующим поколением клеток», - объясняет Цуцуи. «Вектор pKIR был идеальным, поскольку он может непрерывно экспрессировать белок Cas9 на стадии яйцеклетки и стадии развития».
Команда впервые попыталась нокаутировать ген PDS3 (фитоен-десатураза 3), который, как известно, отвечает за синтез хлорофилла в растениях. Без хлорофилла растение станет видом-альбиносом с белым внешним видом. Экспрессируя Cas9 с помощью pKIR, Цуцуи удалось наблюдать нокаут гена PDS3, на что указывает появление растения-альбиноса.
Tsutsui также исследовал влияние на количество хлорофилла, синтезируемого в цветочном стебле, когда ген PDS3 был нокаутирован. При использовании промотора 35S для экспрессии Cas9 количество хлорофилла лишь немного отличалось от количества, наблюдаемого у дикого типа. С другой стороны, когда Cas9 индуцировался с помощью pKIR, количество хлорофилла резко уменьшалось, что свидетельствует об эффективном нокауте гена.
Команда также обнаружила, что вектор pKIR успешно нокаутирует другие гены у Arabidopsis thaliana, такие как AGAMOUS (AG), DUO1 (DUO POLLEN 1) и ADH1 (ALCOHOL DEHYDROGENASE 1), которые участвуют в развитии цветка, сперматозоид и фермент, превращающий спирт в альдегиды соответственно.
AGAMOUS - фактор транскрипции, участвующий в развитии цветка (меристема цветка). После нокаута гена AGAMOUS, индуцированного pKIR, с высокой частотой наблюдался цветок внутри цветка, известный как двойной цветок. Кроме того, в эксперименте с нокаутом гена DUO1, который кодирует мужскую зародышевую линию, индуцированного pKIR, клеточное деление генеративной клетки было нарушено, и наблюдалась нефертильная спермоподобная клетка.
Ген ADH1, который кодирует фермент, превращающий аллиловый спирт в акролеин (альдегид), также с высокой частотой был нокаутирован индукцией pKIR. Такая высокая частота свидетельствует о том, что ген ADH1 был нокаутирован во всех репродуктивных клетках (яйцеклетки и сперматозоиды) в первом поколении. Мутанты с нокаутом гена ADH1 смогли выжить, а растения дикого типа и гетерозиготные погибли из-за образования токсичного для растений акролеина.
«Поскольку все виды во втором поколении показали одинаковый образец мутации, это указывает на то, что редактирование генома произошло на ранней стадии развития (в яйцеклетках первого поколения)», - описывает Цуцуи.
Чтобы легко идентифицировать виды с установленными генами CRISPR/Cas9, семена, содержащие Cas9, помечены красной флуоресценцией.
Цуцуи и Хигасияма нашли эффективный метод редактирования генома Arabidopsis thaliana, заключающийся в экспрессии Cas9 с промотором RPS5A (вектор pKIR), который может нокаутировать гены в клетках на ранней стадии развития и индуцировать мутации, которые могут передаваться дочерним клеткам в следующем поколении.
«Этот метод pKIR позволяет нам исследовать кластеры генов, которые могут иметь перекрывающиеся функции», - говорит Цуцуи. «Ранее нам приходилось создавать несколько нокаутных растений путем скрещивания существующих мутантов для изучения перекрывающихся функций генов, что требовало времени. Мы должны были иметь возможность исследовать функции неопознанных генных кластеров, имея возможность быстрого доступа к мутантам с помощью нашего относительно недорогого метода."
«Мы надеемся, что сможем продолжить совершенствовать этот метод, чтобы повысить эффективность мутаций, чтобы он стал полезным инструментом геномной инженерии для модификации целевых последовательностей ДНК в различных организмах», - говорит Хигасияма.