Природа дала нам множество противомикробных препаратов. Однако, учитывая быстрое увеличение устойчивости к противомикробным препаратам, существует необходимость в разработке новых для природы антибиотиков. Лантибиотики - интересный вариант. Молекулярные биологи из Университета Гронингена и их коллеги из Швейцарии и Германии разработали конвейер для создания и скрининга большого количества новых лантибиотических пептидов. Описание метода и первые результаты были опубликованы 1 апреля в журнале Nature Chemical Biology.
Лантибиотические пептиды модифицируются после того, как они произведены рибосомами. Ферменты могут связывать различные аминокислоты в пептидной цепи, образуя кольца. Хорошо известным лантибиотиком является низин, пептид с пятью кольцами, который используется в качестве консерванта в пищевой промышленности. «Существуют различные последовательности аминокислот, из которых состоят кольца», - объясняет профессор молекулярной биологии Гронингенского университета Оскар Кейперс. «Мы знаем, что выбор из 12 природных лантибиотиков имеет разные комбинации».
Синтетические гены
Койперс и его коллеги из ETH Zürich (Швейцария) и Университета Регенсбурга (Германия) разработали систему для создания большого количества новых лантибиотиков: «Мы синтезировали цепи ДНК, кодирующие различные кольца, и объединили эти генетические модули для образуют лантибиотические гены, кодирующие случайные комбинации пяти колец». Генная библиотека, которую они создали, содержала около 14 000 синтетических генов.
Следующим шагом был скрининг генных продуктов на антимикробный потенциал. Для этого они модифицировали метод, разработанный для скрининга ферментов, на основе микроальгинатных шариков. Внутри этих шариков - каждый диаметром около 70 микрометров - могут расти бактерии. Гены из библиотеки были помещены в штамм-продуцент, содержащий красный флуоресцентный маркер. «Мы разбавили эти бактерии, чтобы в итоге получить одну или ноль клеток на шарик. Мы также добавили целевой штамм, который мог быть уничтожен лантибиотиками; эти клетки использовались в более высокой концентрации, около 50 на гранулу». Клетки-мишени несли зеленый флуоресцентный маркер и продуцировали пептидазу, которая активировала предшественники лантибиотиков, секретируемых клетками-продуцентами.
Показ
При инкубации бусинок штамм-продуцент образовывал внутри одну колонию, секретирующую лантибиотики. Эти пептиды не могли покинуть гранулы. Количество зеленых колоний, растущих внутри каждого шарика, отрицательно коррелировало с антимикробным действием активированных лантипептидов. С помощью флуоресцентного сортировщика клеток, предназначенного для частиц, можно было просеивать 50 000 гранул в час и отбирать гранулы с низким уровнем зеленой флуоресценции.
Но этот скрининг ни в коем случае не был концом работы, которую необходимо было проделать. Следующим шагом было выделение колоний-продуцентов из отобранных гранул, которые проявляли сильный антимикробный эффект. Это было просто; однако точная характеристика образовавшегося продукта оказалась затруднительной из-за низкого уровня продукции внутри шарика. «Сначала нам пришлось выращивать их в больших количествах, прежде чем мы смогли проанализировать произведенный лантибиотик». Еще одна сложность заключалась в том, что ферменты, производящие кольца, не работали с идеальной точностью. «Даже в одной колонии, где все клетки имеют одинаковую ДНК, может продуцироваться до пяти или шести различных лантипептидов».
Рациональный дизайн
В итоге была выделена и охарактеризована серия лантипептидов с сильным антимикробным действием.«Мы обнаружили пептиды с разной антибиотической активностью, хотя некоторые пептиды немного напоминали низин или эпидермин. Оказалось, что мы даже воссоздали низин в нашей генной библиотеке». Эксперимент предоставил много информации о структурно-функциональных отношениях различных колец в пептидах лантибиотиков. Теперь это можно использовать для рационального подхода к разработке новых антибиотиков.
Второй вывод из исследования заключается в том, что конвейер - от создания библиотеки генов до скрининга и характеристики - работает очень эффективно. Следующим шагом является использование настоящего патогена в качестве репортерного штамма вместо клеток Lactococcus, использованных в первом раунде. «И сейчас мы работаем над созданием пептидов всего с одним кольцом. Пептиды с пятью кольцами, которые мы получили в этом исследовании, слишком велики для фармацевтического применения. Многие антибиотики имеют структуру с одним кольцом, как у ванкомицина». Эти антибиотики производятся путем специфического ферментативного связывания аминокислот, тогда как лантибиотики производятся из генов с помощью рибосом.«Это означает, что мы можем использовать быстрые методы молекулярной биологии для создания и проверки больших библиотек».