Используя технику, позволяющую точно редактировать основания ДНК, исследователи Массачусетского технологического института создали способ хранения сложных «воспоминаний» в ДНК живых клеток, включая клетки человека.
Новую систему, известную как DOMINO, можно использовать для записи интенсивности, продолжительности, последовательности и времени многих событий в жизни клетки, таких как воздействие определенных химических веществ. Эта память может служить основой для сложных цепей, в которых одно событие или серия событий запускают другое событие, например, выработку флуоресцентного белка.
«Эта платформа дает нам способ масштабируемого кодирования памяти и логических операций в ячейках», - говорит Фахим Фарзадфард, научный сотрудник Массачусетского технологического института им. Шмидта и ведущий автор статьи. «Подобно компьютерам на основе кремния, чтобы создавать сложные формы логики и вычислений, нам нужен доступ к огромным объемам памяти».
Применения этих типов сложных цепей памяти включают в себя отслеживание изменений, происходящих от поколения к поколению по мере дифференциации клеток, или создание датчиков, которые могли бы обнаруживать и, возможно, лечить больные клетки.
Тимоти Лу, адъюнкт-профессор электротехники, информатики и биологической инженерии Массачусетского технологического института, является старшим автором исследования, опубликованного в августовском номере.22 выпуск журнала Molecular Cell. Среди других авторов статьи - аспирант Гарвардского университета Нава Гараеи, бывший исследователь Массачусетского технологического института Ясутоми Хигашикуни, аспирант Массачусетского технологического института Гиён Юнг и постдоктор Массачусетского технологического института Джиконг Цао.
Записано в ДНК
Несколько лет назад лаборатория Лу разработала систему хранения памяти, основанную на ферментах, называемых ДНК-рекомбиназами, которые могут «переворачивать» сегменты ДНК, когда происходит определенное событие. Однако этот подход ограничен по масштабу: он может регистрировать только одно или два события, потому что последовательности ДНК, которые необходимо перевернуть, очень велики, и для каждой требуется своя рекомбиназа..
Затем Лу и Фарзадфард разработали более целенаправленный подход, при котором они могли вставлять новые последовательности ДНК в заранее определенные места в геноме, но этот подход работал только в бактериальных клетках. В 2016 году они разработали систему хранения данных на основе CRISPR, системы редактирования генома, которая состоит из фермента, разрезающего ДНК, называемого Cas9, и короткой цепи РНК, которая направляет фермент в определенную область генома.
Этот процесс, основанный на CRISPR, позволил исследователям вставлять мутации в определенные участки ДНК, но он полагался на собственный механизм репарации ДНК клетки для создания мутаций после того, как Cas9 разрезал ДНК. Это означало, что результаты мутаций не всегда были предсказуемы, что ограничивало объем информации, которую можно было сохранить.
Новая система DOMINO использует вариант фермента CRISPR-Cas9, который производит более четко определенные мутации, поскольку он напрямую модифицирует и сохраняет биты информации в основаниях ДНК, а не разрезает ДНК и ждет, пока клетки исправят повреждения. Исследователи показали, что они могут заставить эту систему точно работать как в человеческих, так и в бактериальных клетках.
«Эта статья пытается преодолеть все ограничения предыдущих», - говорит Лу. «Это значительно приближает нас к конечному видению, которое состоит в том, чтобы иметь надежные, хорошо масштабируемые и определенные системы памяти, подобные тому, как будет работать жесткий диск».
Для достижения более высокого уровня точности исследователи прикрепили версию Cas9 к недавно разработанному ферменту «основного редактора», который может преобразовывать нуклеотидный цитозин в тимин без разрыва двухцепочечной ДНК.
Направляющие нити РНК, которые указывают базовому редактору, где сделать этот переключатель, производятся только тогда, когда в клетке присутствуют определенные входы. Когда присутствует один из целевых входов, направляющая РНК ведет редактора базы либо к участку ДНК, добавленному исследователями к ядру клетки, либо к генам, обнаруженным в собственном геноме клетки, в зависимости от приложения. Измерение результирующих мутаций цитозина в тимин позволяет исследователям определить, чему подверглась клетка.
«Вы можете спроектировать систему так, чтобы каждая комбинация входных данных давала вам уникальную мутационную сигнатуру, и по этой сигнатуре вы могли сказать, какая комбинация входных данных присутствовала», - говорит Фарзадфард.
Сложные расчеты
Исследователи использовали DOMINO для создания схем, выполняющих логические вычисления, включая вентили И и ИЛИ, которые могут обнаруживать наличие нескольких входов. Они также создали схемы, которые могут записывать каскады событий, происходящих в определенном порядке, подобно падению костяшек домино.
Большинство предыдущих версий хранения клеточной памяти требовали, чтобы сохраненные воспоминания читались путем секвенирования ДНК. Однако этот процесс разрушает клетки, поэтому с ними нельзя проводить дальнейшие эксперименты. В этом исследовании исследователи разработали свои схемы таким образом, чтобы конечный результат активировал ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Измеряя уровень флуоресценции, исследователи могли оценить, сколько мутаций накопилось, не убивая клетки. Эта технология потенциально может быть использована для создания иммунных клеток мыши, которые производят GFP при активации определенных сигнальных молекул, которые исследователи могут анализировать, периодически беря образцы крови у мышей.
Исследователи говорят, что еще одним возможным применением является разработка схем, которые могут обнаруживать активность генов, связанных с раком. Такие цепи также можно запрограммировать на включение генов, которые производят молекулы, борющиеся с раком, что позволит системе обнаруживать и лечить болезнь. «Это приложения, которые могут быть далеки от реального использования, но, безусловно, поддерживаются технологиями такого типа», - говорит Лу.
Исследование финансировалось Национальным институтом здравоохранения, Управлением военно-морских исследований, Национальным научным фондом, Агентством перспективных оборонных исследовательских проектов, Центром микробиомной информатики и терапии Массачусетского технологического института, а также программой NSF Expeditions in Computing Program. Награда.